ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27521—2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法 RT-PCR assay for swine influenza virus nucleic acid 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27521—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 察所。 本标准主要起草人：乔传玲、韩雪清、杨焕良、刘业兵、陈艳、吴绍强、陈化兰、林祥梅、辛晓光、朱中武 王慧煜、刘建、李建、梅琳、王伊琴、徐彪、阮周曦、宁宜宝、薄清如、秦智锋、林志雄。 I GB/T 27521—2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法的技术要求。 本标准规定的RT-PCR检测方法适用于检测猪肺脏组织、鼻腔及气管分泌物和这些采集样品培养 物中的猪流感病毒核酸。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate) EB：溴化乙锭（ethidiumbromide) M-MLVRT：莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（moloneymurineleukemiavirusreversetran- scriptase) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) RNAaseinhibitor:RNA酶抑制剂 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction） SPF：无特定病原体（specificpathogenfree） TaqDNApolymerase:TaqDNA聚合酶 3仪器 3.1 PCR仪。 3.2 台式低温高速离心机。 3. 3 电泳仪。 3.4电泳槽。 3.5冰箱。 3.6 凝胶成像系统。 3.7 微量移液器。 3.8 水浴锅。 4试剂 4.1LSTRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。 4.2氯仿、异内醇、无水乙醇。 4.31.2%琼脂糖凝胶，见附录A中A.1。 4.450XTAE缓冲液，见附录A中A.2。 1 GB/T 27521—2011 4.5 溴化乙锭（EB,10μg/μL)或核酸染料，见附录A中A.3。 4.6 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水，见附录A中A.4。 4.7 DNA分子量标准（100bp）。 4.8 M-MLV反转录酶。 4.9 RNA酶抑制剂。 4.10 TaqDNA聚合酶。 4. 11 dNTP。 4.12 2商品化的一步法RT-PCR反应试剂。含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA 酶的水等。 5引物 5.1斤 反转录引物见附录B中B.1。引物浓度为20pmol/μL。 5. 2 PCR引物见附录B中B.2。引物浓度均为20pmol/μL。 6样品对照 以灭活的猪流感病毒感染SPF鸡胚尿囊液或者感染动物的组织作为阳性对照，以正常SPF鸡胚尿 囊液或者正常动物组织作为阴性对照 操作步骤 7.1样品的采集及处理 7. 1. 1 采样工具 下列采样工具应经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干： a) 棉拭子； b) 剪刀； c) 镊子； d）1.5mL离心管； e) 研钵。 7. 1. 2 活猪 取鼻拭子。采集方法如下：将棉拭子深入鼻腔旋转，取鼻腔分泌液；将采样后的拭子分别放人盛有 1.0mLPBS（见附录A中A.5）的1.5mL离心管中，加盖、编号 7. 1. 3 病死猪 取肺脏或气管分泌物等。采集方法如下：用无菌镊子和剪刀采集肺脏等，装入一次性塑料袋或其他 灭菌容器，编号。 7.1.4样品购运 样品采集后，放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，24h 内送实验室。 2 GB/T 27521—2011 7.1.5样品处理 7.1.5.1棉拭子处理方法 样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，弃去子，室温静置30min， 4℃、3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。 7.1.5.2脏器处理方法 研磨；4℃、3000r/min离心15min取上清液转人无菌的1.5mL离心管中，编号备用。 7.2RNA的提取 7.2.1用LSTRIzol试剂提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的RNA。 7.2.2250μL样品处理液和750μLLSTRIzol置人一个1.5mL离心管，振荡数次，静置5min。 7.2.3加200μL氯仿，振荡混匀，室温放置5min，4℃12000r/min，离心15min。 7.2.4吸取上层水相至一新离心管中，加人等量异内醇，混匀，室温放置15min，4℃、12000r/min离 心15min，离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉淀（对于细胞毒而言，可能看不到沉淀）。弃 上清。 7.2.5小心吸弃上清，加人500μL75%乙醇（DEPC水配置），小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，4℃、 12000r/min，离心5min。 7.2.6小心吸弃上清，沉淀置室温条件下干燥后，加适量DEPC水溶解。 7.2.7提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，须放置一70℃冰箱保存。 7.2.8也可采用商品化的基因组RNA提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴、阳性对照样品 RNA的提取。 7.3RT-PCR 7.3.1一步法反应操作步骤（如实验室有商品化的一步法RT-PCR反应试剂采用此操作步骤） 7.3.1.1在0.2mL反应管中依次加入： 一步法RT-PCR缓冲液 10 μL dNTP(10 mmol/L) 2. 0 μL 酶混合物 2. 0 μL RNA酶抑制剂 0. 5 μL 上游引物 0.5 mL 下游引物 0.5μL RNA模板 5 μs DEPC水 29.5μL 上述体系根据扩增目的片段不同，分别选择相应的M、HIHA、甲H1HA、H3HA、N1NA及N2NA 单个基因的上/下游引物进行反应。 7.3.1.2采用PCR仪立即进行RT-PCR扩增。检测同时设立阴、阳性对照。 7.3.1.3RT-PCR反应条件为：48℃45min;94℃2min；然后94℃30s,50℃1min,68℃2min， 共40个循环；最后68℃延伸7min。 7.3.2.1RT取5μLRNA,加1μL反转录引物（Uni12）,70℃水浴5min。 3