ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T15399—2018 代替GB/T15399—1994 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法 Determination of sulfur amino acids in feeds- Ion exchange chromatography 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T15399—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T15399—1994《饲料中含硫氨基酸测定方法离子交换色谱法》。 本标准与GB/T15399一1994相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 范围中适用对象增加了精料补充料，并增加了方法的定量限（见第1章）； 修改了原理的表述（见第3章，1994年版的第3章）； 过甲酸氧化溶液中添加了苯酚（见4.5，1994年版的4.1）； 偏重亚硫酸钠作终止剂水解时给出警示（见7.1.2）； 测定中增加了对蛋氨酸砜的分离度及试样峰面积大小的要求（见7.2）； 修改了试验数据处理中的计算公式（见第8章）； 增加了氨基酸混合标准溶液的色谱图（见附录A)。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心 （北京）、通威股份有限公司 本标准主要起草人：赵根龙、贾铮、李兰、宋军、赵艳、张凤秤。 本标准所代替标准历次版本发布情况： GB/T15399—1994。 1 GB/T15399—2018 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法 1范围 本标准规定了饲料中含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸）的离子交换色谱法测定法。 本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中含硫氨基酸的测定。 胱氨酸（含半胱氨酸）和蛋氨酸的定量限均为0.01%。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6439饲料中水溶性氯化物的测定 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 JJG1064 氨基酸分析仪 3原理 饲料中的含硫氨基酸用过甲酸氧化和盐酸溶液水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，经离子交换色谱 法分离，节三酮柱后衍生，分光光度法检测，外标法定量 4 试剂或材料 除特殊说明外，所用试剂均为分析纯。 4.1水：应符合GB/T6682中一级用水的规定。 4.2 2盐酸：优级纯。 4.3 甲酸：浓度为88%。 4.4氢氧化钠：优级纯。 4.5 过甲酸溶液I：将过氧化氢十甲酸=1十9，混合，并按每毫升添加5mg比例加人苯酚，于室温下放 置1h，置冰水浴中冷却30min。临用现配。 4.6过甲酸溶液Ⅱ：在过甲酸溶液I（4.5）中按每毫升添加3mg比例加人硝酸银。 过甲酸溶液Ⅲ：在过甲酸溶液I（4.5）中加入适量硝酸银，每毫升添加量按式（1）计算： mR≥1.454XmXCn .(1) 式中： mR一一每毫升过甲酸中硝酸银的量，单位为毫克（mg）； C——样品中氯化钠含量，%； m-样品质量，单位为毫克（mg）。 1 GB/T15399—2018 4.8盐酸溶液（6mol/L）：量取盐酸（4.2）500mL，用水稀释至1000mL，混匀。 4.9盐酸溶液（6.8mol/L）：量取盐酸（4.2)1133mL用水稀释至2000mL，混匀。 4.10氢氧化钠溶液（7.5mol/L）：取氢氧化钠30g，加水溶解并定容至100mL 4.11柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸三钠19.6g，用水溶解后加人盐酸16.5mL,硫二甘醇5.0mL,苯酚 1g，最后加水定容至1000mL，过滤。 4.12偏重亚硫酸钠溶液：称取33.6g偏重亚硫酸钠加水溶解并定容至100mL。 4.13洗脱用柠檬酸钠缓冲溶液：按仪器说明书配制或购买。 4.14三酮溶液：取节三酮适量，按仪器说明书配制或购买。 （纯度纯度≥99.0%）113.3mg，加水溶解并定容至250mL，浓度均为2.50umol/mL，2℃～8℃保存， 有效期1年。 4.16氨基酸标准储备液：含17种常规蛋白水解液分析用氨基酸（天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨 酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨 酸和精氨酸），各组分浓度均为2.50mol/mL，应使用有证标准溶液。 4.17混合氨基酸标准工作液：吸取磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准贮备液（4.15）和氨基酸标准贮备液 （4.16）各1.00mL置于50mL容量瓶中，加柠檬酸钠缓冲液（4.11）定容，混匀。有关各组分浓度均为 50nmol/mL,2℃～8℃保存，有效期3个月。 5仪器设备 5.1氨基酸自动分析仪：具有阳离子交换柱、节三酮柱后衍生装置及570nm和440nm光度检测器。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01mg。 5.3喷灯。 5.4旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65℃间调温，控温精度土1℃，真空度可低至3.3×10*Pa (25 mm Hg)。 5.5恒温干燥箱：温度可达110℃土2℃。 6样品 按GB/T14699.1采集有代表性的样品，按GB/T20195进行样品制备。粉碎过0.25mm孔径筛， 混合均匀，装人密闭容器，备用。 浓缩饲料应首先按GB/T6439测定其NaCI含量。 7试验步骤 7.1氧化和水解 平行做两份试验，称取试样50mg~75mg（约含蛋白质7.5mg~25mg，精确至0.1mg），置于 20mL试管中，于冰水浴中冷却30min后加入已冷却的过甲酸溶液I（4.5），如样品是浓缩饲料，视其 氯化钠含量加过甲酸溶液[氯化钠含量小于等于3%的加人过甲酸溶液Ⅱ（4.6），氯化钠含量大于3%加 人过甲酸溶液Ⅲ（4.7）2mL，加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一道置于 2 GB/T15399—2018 0℃~4℃冰箱中，反应16h 以下步骤依使用不同的氧化终正剂而不同： 若以氢溴酸为终止剂：于各管中加入氢溴酸0.3mL振摇，放回冰浴，静置30min，然后移到旋 （B 转蒸发器或浓缩器（5.4）上，在60℃、低于3.3×10Pa（25mmHg）下浓缩至干。用盐酸溶 液（4.8)约15mL将残渣定量转移到20mL安瓶或水解管中，封口或旋紧管盖，置恒温箱 中,110℃±2℃下水解22h~24h。 取出安瓶或水解管，冷却，用水将内容物定量地转移至50mL容量瓶中，定容。充分混匀，过 加少许水重复蒸干2次～3次。准确加入一定体积（2mL～5mL）的柠檬酸钠缓冲液（4.11）振 摇，充分溶解后离心，取上清液供仪器测定用 b）若以偏重亚硫酸钠为终止剂：则于样品氧化液中加入偏重亚硫酸钠溶液（4.12）0.5mL，充分 摇匀后，直接加人盐酸溶液（4.9)17.5mL置110℃土2℃恒温箱中水解，水解22h～24h。 警示一一在水解开始时，不要封安瓶瓶口，或旋动水解管的管帽，待水解1h后再封口或旋 紧管帽，否则容易引起水解管爆裂、 取出安瓶或水解管，冷却，用水将内容物转移到50mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液（4.10）中 和至pH约2.2，并用稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.11)定容，离心，取上清液供仪器测定用。 注：有些氨基酸分析仪，上机试样溶液的Na+浓度会影响色谱峰出峰时间或氨基酸的分离，对此需先将水解 液定容过滤，取2mL～5mL滤液，于50℃下，减压蒸发至药0.5mL（切勿蒸干），用稀释上机用柠檬酸钠 缓冲液（4.11)将其转移至10mL容量瓶中，加氢氧化钠溶液（4.10)调至pH2.2,并用稀释缓冲液（4.11)定 容。混匀，离心，取上清液供仪器测定用。 7.2测定 使用混合氨基酸标准工作液（4.17）注人氨基酸自动分析仪，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱 用缓冲溶液试剂配比，应符合JJG1064氨基酸分析仪检定规程的要求并保证蛋氨酸砜与天门冬氨酸的 分辨率大于85%，其标准溶液色谱图参照附录A的图A.1。测定中每5个样品（即10个单样）为一组， 组间插人混合氨基酸标准工作液（4.17）进行校准。以保留时间定性，单点外标法定量。试样中氨基酸 的峰面积应在相应标准工作液该峰面积的30%～200%之间，否则应用柠檬酸钠缓冲液（4.11）稀释后 重测。 8试验数据处理 试样中胱氨酸（蛋氨酸）含量以其质量分数表示，数值以克每100克表示，按式（2)计算： X100 .......(2) A.tXmXVX106 式中： A，一一试样溶液中磺基内氨酸（蛋氨酸）的峰面积： V—试样水解液体积，单位为毫升（mL）； 一一标准工作液中磺基丙氨酸（蛋氨酸砜）浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）； c V 试样溶液进样体积，单位为微升（μL）； 试样水解液稀释倍数； Vst 氨基酸标准溶液进样体积，单位为微升（μL）； 3 GB/T15399—2018 At 氨基酸标准溶液中磺基丙氨酸（蛋氨酸砜）的峰面积； m 试样质量，单位为毫克（mg）； M 胱氨酸（蛋氨酸）的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）。（胱氨酸实为胱氨酸与半胱氨酸 之和，以胱氨酸计；其M胱氨酸=120.2；M蛋氨酸=149.2）。 以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结