ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36770—2018 澳洲葡萄类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Australian grapevine viroid 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36770—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人:邓丛良、张永江、王英超、向均、赵晓丽、谢丽雪 GB/T36770—2018 澳洲葡萄类病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了澳洲葡萄类病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能带有澳洲葡萄类病毒的葡萄繁殖材料的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 澳洲葡萄类病毒基本信息 学名:Australian grapevine viroid 缩写:AGVd 异名:澳大利亚葡萄类病毒 分类地位:马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)、苹果锈果类病毒属(Apscaviroid) 澳洲葡萄类病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 类病毒检测主要针对其核酸序列。主要的方法有反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和核酸分子 杂交。 仪器设备、主要用具和主要试剂 5 5.1仪器设备 电子天平(感量0.001g)、普通天平(感量0.1g)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超 低温冰箱(一80℃)、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光定量PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、恒 温水浴锅、组织破碎仪等。 S 5.2主要用具 可调移液器(2.5μL,10μL,20μL,200μL,1000μL,5000μL)、无RNA酶吸头(10μL, 20μL,200μL,1000μL,5000μL)、无RNA酶离心管(1.5mL,5mL,10mL)、研钵、研棒、磁性分 离架、PCR反应管(200μL)、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交袋、X光片。 5.3主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。普通RT-PCR检 1 GB/T36770—2018 测试剂见附录B;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C;斑点杂交检测试剂见附录D。 检测与鉴定 6 6.1 普通RT-PCR检测方法 普通RT-PCR检测方法见附录B。 6.2 实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-PCR检测方法见附录C。 6.3 3斑点杂交检测方法 斑点杂交检测方法见附录D。 7结果判定 样品经普通RT-PCR检测为阳性,且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性,则判 定为检出AGVd 样品经普通RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的AGVd序列一致,则判定为检出 AGVd. 样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的AGVd序列一致,则判定为检出 AGVd。 A8样品保存与结果记录 8.1样品保存 完整的实验记录要包括:样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果,并有实验 人员的签字;普通RT-PCR检测结果保存电泳照片及测序结果;实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光 曲线图及Ct值;斑点杂交检测保存照片。 8.2 2样品保存与处理 样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月,种子保存在4℃冰箱内,生长苗木或插条保存在隔 离温室中培养,叶片、果实等样品在一80℃冰箱内保存。对检出澳洲葡萄类病毒的样品应至少保存 6个月,以备复核、谈判和仲裁。保存期满后,应灭活处理。 2 GB/T36770—2018 附录A (资料性附录) 澳洲葡萄类病毒相关资料 A.1寄主范围 自然条件下侵染葡萄(Vitisvinifera)。 A.2 病害症状 寄主受AGVd侵染后,多表现隐症。 A.3 分布地区 澳大利亚、美国、突尼斯、中国。 A.4 传播方式 AGVd主要通过嫁接传播和机械传播,也可通过种子传播。 A.5 基因组 AGVd为单链环状的RNA分子,长369个核苷酸残基。 SzC 3 GB/T36770—2018 附录B (规范性附录) 普通RT-PCR检测方法 B.1 主要试剂 B.1.11mol/L磷酸氢二钾(K,HPO.) 17.42 g 磷酸氢二钾 加双蒸水定容至100mL,用0.22μm滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。 B.1.2 2.5mol/L磷酸氢二钾(KzHPO4) 43.55 g 磷酸氢二钾 加双蒸水定容至100mL,用0.22μm滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。 B.1.33mol/L乙酸钠(NaAc)(pH 5.2) 三水乙酸钠 40.83 g 用3mol/L乙酸调节pH至5.2,用双蒸水定容至100mL,高压蒸汽灭菌。 B.1.44 mol/L氯化锂(LiCI) 氯化锂 16.96 g 加双蒸水定容至100mL。用0.22um滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。贮存于4℃。 B.1.5 研磨缓冲液 异硫氰酸胍(GITC) 4 mol/L 十二烷基肌氨酸钠 5 g/L 曲拉通X-100(TritonX-100) 0.1%(体积分数) 氯化钠(NaCI) 10 mmol/L 柠檬酸钠缓冲液(pH7.0) 25 mmol/L 聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 20 g/L B.1.6 50×TAE缓冲液 Tris碱 242 g 冰乙酸 57.1 mL 乙二胺四乙酸(EDTA)(0.5 mol/L,pH 8.0) 100 mL 加双蒸水定容到1L。 B.1.7 6×Loading缓冲液 溴酚蓝 2.5 g/L 二甲苯青FF 2.5 g/L 燕糖水溶液 400 g/L 4 GB/T 36770—2018 贮存于4℃。 B.2引物序列 正向引物 AGVdF:5'-ACCTGCAGGGAAGCTAGCTGGGTC-3'; 反向引物AGVdR:5'-CCCTGCAGGTTTCGCCAGCAAGCGC-3'; 扩增片段大小为369bp。 B.3试验步骤 B.3.1RNA的提取 B.3.1.1方法一(LiCI方法) 取1g叶片样品,加液氮研磨成粉末状,将研磨物迅速移人10mL离心管中,并加入2mL1mol/L 磷酸氢二钾和8μL巯基乙醇,混勾,再加人2mL水饱和酚:氯仿(体积比为1:1),涡旋1min,充分混 匀;4℃,10000g离心10min。取上层液体,加入同体积的水饱和酚:氯仿(体积比为1:1),充分混 匀;4℃,10000g离心10min。取上层液体,加入2.5倍体积的无水乙醇,充分混匀;一20℃下放置 2h~4h或-80℃下放置至少30min;4℃,10000g离心10min。取沉淀,加1mL无RNA酶的水 匀;4℃,12000r/min离心10min。取上层液体,加人无RNA酶的水至10mL,再加入100μL20g/L 的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液,充分混勾,冰浴3h~4h;4℃,10000g离心10min。取沉淀, 加入2mL无RNA酶的水充分溶解后,加入5mL无水乙醇、0.2mL3mol/L乙酸钠(pH5.2),充分混 匀,一20℃下放置至少2h;4℃,10000g离心10min。取沉淀,加200μL无RNA酶的水反复吹打, 待沉淀充分溶解后,将溶解物移人1.5mL离心管中;加人200μL4mol/L氯化锂,充分混匀,冰浴至少 4h;4℃,10000g离心10min。取上层液体于1.5mL离心管中,加入2.5倍体积的无水乙醇,混匀, 一20℃下放置至少2h或一80℃下放置至少30min;4℃,10000g离心10min。取沉淀,70%乙醇 清洗沉淀;4℃,10000g离心2min;取沉淀,待其干燥后,加人50uL~60μL无RNA酶的水充分溶 解,一20℃下保存备用。 B.3.1.2方法二(CTAB方法) 取0.1g样品,加液氮研磨成粉未状,将研磨物迅速移入1.5mL离心管中,加入加入预热的CTAB 提取缓冲液900uL,以及2%的琉基乙醇,颠倒混匀,65℃孵育10min,加人等体积的氯仿:异戊醇 离心10min;取上清,加入10mol/L的氯化锂至终浓度3mol/L,冰浴30min,4℃,12000g离心 20min;弃上清,加入65℃预热的SSTE缓冲液500μL溶解沉淀,以及等体积的氯仿:异戊醇(24+ 1),混匀;4℃,11000g离心10min,取上清移人1.5mL离心管,加人700μL预冷的异丙醇,一20℃ 沉淀30min。4℃,12000g离心20min;沉淀用70%乙醇洗涤两次,4℃,12000g离心2min;去除 上清液,沉淀自然干燥后,将其溶于30μL~50μL无RNA酶的水中。 B.3.1.3方法三(纳米磁珠方法) 5

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