ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36778—2018 燕麦花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Oat mosaic virus 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36778—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、浙江省农业科学院、中华人民共和国北 京出人境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局 本标准主要起草人：郭立新、段维军、梁新苗、杨永生、孙丽英、吴薇、荣德福 GB/T36778—2018 燕麦花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了燕麦花叶病毒的血清学、分子生物学及免疫电镜检测与鉴定方法 本标准适用于燕麦属（Avena）植株、种子及种子中夹杂的土壤上的燕麦花叶病毒的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3燕麦花叶病毒基本信息 3 学名：Oat mosaic virus。 异名：Soil-borne oat mosaic virus。 缩写:OMV。 分类地位：马铃薯Y病毒科（Pityoiridae）、大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）。 燕麦花叶病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及免疫电镜 (IEM)检测是本标准制定的主要依据。 5 仪器设备和主要试剂 5.1仪器设备 电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速冷冻离心机、小型离心机、超低温冰箱 （一80℃）、制冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、电泳仪、电泳 槽、凝胶分析成像系统、酶标仪、洗板机、透射电子显微镜。 5.2主要试剂 所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA检测试剂见附录B； RT-PCR检测试剂见附录C;IEM检测试剂见SN/T1840。 1 GB/T36778—2018 6检测样品制备 6.1种子 抽样按照SN/T2122的规定执行 挑取至少1000粒种子样品，将其分成若干份，每份25粒～100粒。用灭菌蒸馏水浸泡种子，待种 子泡软后（约12h～24h）进行试验。 6.2 2植株 抽样按照SN/T2122的规定执行。 对于有症状的植株样品编号单独检测，检测时选取全部表现症状的叶片。未表现症状的植株样品 分组（10株为1组）并编号检测，检测时选取幼嫩叶片进行试验， 7检测与鉴定 7.1DAS-ELISA方法 DAS-ELISA检测时，将使用的点样孔安排在酶联板内部，避免使用酶联板周围一圈的点样孔，防 止边际效应的发生，影响检验结果的准确性。在一次血清学检测试验中，一般设置2个阳性对照孔、2 个阴性对照孔、2个空白对照孔作为质量控制，并根据送检样品数量设置待检样品孔数量，要求每个待 检样品设置两次重复。 具体检测方法见附录B。 7.2 2一步RT-PCR方法 RT-PCR检测时，每个样品设置两个平行反应。检测时以感染燕麦花叶病毒的植物组织作为阳性 对照，以健康植物组织作为阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照。 具体检测方法见附录C。 7.3 3IEM检测方法 利用燕麦花叶病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征， 具体检测方法见SN/T1840。如观察到长600nm～750nm，宽12nm～14nm弯曲线状的病毒粒子， 即可判定IEM检测结果阳性。 8结果判定 若样品经酶联免疫检测结果为阳性，且RT-PCR检测为阳性或IEM检测为阳性，则判定为检出燕 麦花叶病毒。 若样品经RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知燕麦花叶病毒核苷酸序列一致性不低于 80%，则判定为检出燕麦花叶病毒 2 GB/T36778—2018 样品、结果记录与资料保存 9 9.1 样品保存与处理 经检验确定携带燕麦花叶病毒的样品经登记人和经手人签字后妥善保存1年，以备复核，种子保存 蒸汽灭菌后方可处理 9.2 2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。酶联免疫方法需有酶联反应的原始数据，RT-PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片 及序列测定结果，IEM检测需有电镜照片。 3 GB/T36778—2018 附录A （资料性附录） 燕麦花叶病毒其他信息 A,1 病害症状 引起秋播燕麦（AvenasativaL.）发病，燕麦受燕麦花叶病毒侵染后，最初叶片上出现短的褪绿条纹 或条斑，后变为黄斑或叶片萎黄，而随着气温升高，通常会隐症。早春田间发病燕麦植株成片矮化、褪绿 （图A.1）。耐病品种受燕麦花叶病毒侵染，燕麦产量损失25%~50%，易感病品种产量损失高 达100%。 注：引自http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=1436034 图A.1燕麦花叶病毒在燕麦上引起的症状 A,2寄主范围 寄主范围较窄，只局限于燕麦属（Avena）作物。 A.3分布 分布于英格兰、威尔士、爱尔兰、意大利、法国、美国。 A.4粒体形态 病毒粒体为弯曲线状，长600nm~750nm，宽12nm~14nm（见图A.2）。 4 GB/T36778—2018 注1：黑色粗线表示100nm 注2:引自Tomio U。 图A.2燕麦花叶病毒粒体形态 A.5传播方式 主要通过土壤中的禾谷多黏菌（PolymyragraminisL.）进行传播；也可通过汁液摩擦接种传播， 病毒。 A.6抗原特性 具有中等免疫原性，与其他燕麦属作物病毒无血清学关系。 A.7基因组 二分体基因组，由2条线形正义核糖核酸（RNA）组成，即：RNA1和RNA2。RNA1全长为 C端，分子量为28.8ku;RNA2长约3500nt，长期摩擦接种可导致其基因缺失突变。 5