ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36810—2018 草莓枯萎病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Fusarium oxysporum (Schlecht.) f. sp. FragariaeWinks&Williams 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36810—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局 本标准主要起草人：刘跃庭、罗加凤、牛春敬、崔铁军、廖芳 GB/T368102018 草莓枯萎病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了草每枯萎病菌的检疫鉴定方法 本标准适用于草莓苗中及其携带土壤中草莓枯萎病菌的检疫鉴定、 草莓枯菱病菌的基本信息 2 中文名：草莓枯萎病菌 学名：Fusariumorysporum（Schlecht.)f.sp.fragariaeWinks&Williams 英文名：fusariumwiltof strawberry 分类地位：草莓枯萎病菌属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina）， 粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座菌目（Hypocreales），丛赤壳科（Nectriaceae），镰刀菌属（Fusarium）。 传播途径：病菌依靠带菌种苗和土壤进行远距离传播 草莓枯萎病菌的其他信息参见附录A。 3 方法原理 病原菌的为害症状、分离培养性状、形态特征及PCR特异性扩增片段作为草莓枯萎病菌的检疫鉴 定依据。 4仪器用具和主要试剂 4.1仪器用具 显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱（一20℃）。PCR扩增仪、电泳 仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。 培养皿、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种针、移液器、酒精灯。 4.2 2主要试剂 乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基磺酸钠（SDS）、Tris-HCI、异戊醇、三氯甲烷、无水乙醇、70%乙 醇、氯化钾、氯化镁、蛋白酶K、引物FofraF/FofraR、Taq聚合酶等分子生物学试剂。或用植物组织及 真菌基因组提取试剂盒提取DNA。蔗糖、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、0.5%次氯酸钠（NaCIO） 马铃薯蔗糖培养基（PSA）、马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的制备参见附录B。 5 5病菌的鉴定 5.1症状检查 1 GB/T36810—2018 变黄绿或黄色，纵切叶柄、果梗和根部，检查维管束是否变色（参见附录A中图A,1），对变色的可疑材料 进行分离培养。检查植株有无附看着土壤，若发现土壤，对土壤进行分离培养。 5.2病原菌的分离培养 5.2.1种苗中病原菌的分离培养 变色的可疑材料用0.5%次氯酸钠表面消毒5min，再用灭菌水冲洗30min，剪成约3mm~5mm 小段置PSA或PDA平板上，25℃，全光照下培养，培养48h后开始观察菌落形态、大分生孢子、小分生 抱子及厚垣抱子着生情况和形态特征。 5.2.2土壤中病原菌的分离培养 取2g土壤放人200mL灭菌水中，用磁力棒搅拌30min，使其充分混勾，悬浮液稀释10倍，取 48h后开始观察菌落形态、大分生孢子、小分生孢子及厚垣孢子着生情况和形态特征。 5.3分子生物学鉴定 5.3.1引物 采用特异性引物FofraF/FofraR进行扩增，目标片段为239bp。 FofraF:5'-CAGACTGGGGTGCTTAAAGTT-3' FofraR:5'-AACCGCTAGGGTCGTAACAAA-3 5.3.2DNA提取 可疑菌株在PSA或PDA上生长7d左右，取菌丝提取DNA（参见附录C)，也可用植物组织及真菌 基因组提取试剂盒提取DNA，提取步骤详见使用说明， 5.3.3PCR反应 PCR反应体系总体积25μL，包含：EmeraldAmpMaxPCRMasterMix（2XPremix）（Code RR320)12.5μL；ddHzO9.0μL；引物各1.0μL;DNA模板1.5μL（30ng/μL）。PCR反应程序：94℃ 预变性2min；94℃变性1min，63℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃7min，保存于4℃。 段大小的单带。 6鉴定特征 6.1培养性状 在PSA培养基平板上菌落突起，白色致密呈絮状，高3mm～5mm，菌落正面有同心轮纹，背面菌 落呈紫色。在PDA培养基上，2d后出现白色菌丝，3d后开始产孢，7d后菌落呈圆形，边缘白色，向内 逐渐变成粉红色，菌丝细绒状、蓬松，背面菌落呈紫色（参见附录D中图D.1）。 6.2形态特征 菌丝有隔，小型分生孢子居多，着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端处聚成假头状，无色，单孢，长椭圆 形，椭圆形或卵形，无或有1个分隔，大小为（3.9m~13.0um）×（2.6um5.2um）；大型分生抱子较 少，镰刀形或新月形，有脚胞，1个～4个分隔，多为3隔，大小为（13.0μm36.4μm）×（2.6μm～ 2 GB/T36810—2018 5.2μm）。厚垣孢子间生或顶生，球形，大小为（5.2μm~13.00μm）×（5.2μm~13.0μm）（参见附录D 中图D.2）。草莓枯萎病菌与其近似种的区别参见附录E。 6.3PCR特异性产物 引物FofraF/FofraR特异性PCR扩增片段为239bp。 7 结果判定 病原菌培养性状符合6.1中描述，形态特征符合6.2中描述，PCR特异性扩增片段符合6.3中描述 可鉴定为草莓枯萎病菌。 8 3样品保存 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出草莓枯萎病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复 核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 8.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为草莓枯萎病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PSA培养基斜面 上，存活后置于4℃～8℃黑暗条件下保存，定期（3个月）转接，以防止病菌死亡，至少保存6个月，必要 时用病菌分生孢子作冻干菌种保存。保存期满后高压灭活处理。 8.3结果记录与资料保存 实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并有实验人员和审核人员 签字。 SAC 3 GB/T36810—2018 附录A （资料性附录） 草莓枯萎病菌的其他信息 A.1寄主范围 草莓属FragariaL.。 A.2地理分布 欧洲：波兰、西班牙； 美洲：美国； 非洲：埃及； 亚洲：日本，韩国，中国的四川、河北、东北三省、上海； 大洋洲：澳大利亚。 A.3症状特征 草莓枯萎病菌主要侵害根部，表现在地上部分，从开花及收获期发生，心叶变黄绿或黄色卷曲，小叶 变狭小或呈船形，多数变硬。叶色变黄，表面粗糙无光泽，随后叶缘变褐，向内萎，直至枯死。病菌引 起系统症状，导致病株根系环死，生长不良，矮小衰弱，叶无光泽，下部叶片变紫红色萎為，叶柄和果梗的 维管束变褐色或黑褐色，不长新根，潮湿时近地面基部长出紫红色的分生孢子，最后全株枯死，轻病株则 结果减少，果实不能正常膨大，品质低劣。草莓枯萎病菌症状如图A,1所示。 注：引自HosseinGolzar,Australia。 图 A.1 草莓枯萎病菌症状 4 GB/T36810—2018 A.4 传播途径 草莓枯萎病菌是尖孢镰刀菌草莓专化型，不能侵害其他作物，只能通过带病种苗和病土传播。病害 一旦传入，便在采苗床、假植床和大田循环侵染，扩大蔓延，难以除治。土壤传染主要以厚垣孢子作传染 源，而且病菌无论在旱地或水田都能长期生存，并且在20cm的土层内密度最高。如果翌年在带有病菌 的地里育苗，病菌先侵染母株，然后通过匍匐茎、导管再传给子苗，因为苗期症状不明显，而被当作健苗 来移栽。一般靠近母株的苗子发病早，带病率高，发病也严重。病原菌主要靠病根、病叶通过土壤和水 进行扩散传播。酸性潮湿的土壤、夏季持续高温多雨和偏酸的灌溉水均能导致草莓枯萎病菌的严重发 生，冬春季低温干燥时该病发生较轻。 5