ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36816—2018 马铃薯Y病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Potato virus Y 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36816—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、浙江大学、中国检验检疫科学研究院、 黑龙江省农业科学院脱毒苗木研究所。 本标准主要起草人：刘洪义、刘忠梅、梁五生、张永江、张星哲、魏梅生、李桂芬、袁建江、范国权 封立平、杨立群。 GB/T368162018 马铃薯Y病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了马铃薯Y病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能带有马铃薯Y病毒的马铃薯植株、繁殖材料及其他寄主植物的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB7331马铃薯种薯产地检疫规程 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3马铃薯Y病毒基本信息 3 中文名：马铃薯Y病毒 学名：Potato virus Y 缩写：PVY 异名:Potato severe mosaic virus,Potato acropetal necrosisvirus,Solanum virus 2,Tobacco vein banding virus,Potato leafdrop streak virus, Tobacco veinal necrosis virus,Potato virus 20 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyiridae），马铃薯Y病毒属（Potyirus）。 传播途径：马铃薯种薯等无性繁殖材料传毒，机械接种可传毒，多种蚜虫以非持久性方式传播该病 毒。远距离传播通过种薯等无性繁殖材料的贸易完成。据资料，马铃薯实生种子可传带该病毒，但在生 产上意义不大；未见其他茄科作物种子传带该病毒的报道。 马铃薯Y病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 PVY的基因组特征、免疫原性和在寄主植物上的症状特征是该病毒检疫鉴定的依据。依据PVY 及主要株系的基因组特征建立反转录PCR（RT-PCR）、实时荧光反转录PCR（Real-timeRT-PCR）检测 方法：依据PVY及主要株系的免疫原性建立酶联免疫吸附测定（ELISA）方法、免疫层析试纸条检测方 法和免疫电镜检测方法；依据PVY及主要株系在不同寄主植物上的症状特征建立鉴别寄主诊断法；依 据PVY的基因组序列建立焦磷酸测序法鉴别株系群。通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有 PVY及主要株系。 5 仪器设备、用具及试剂 5.11 仪器设备 1 GB/T36816—2018 pH计、凝胶成像系统、常规冰箱、电子天平（0.001g）、涡旋振荡器、组织捣碎机、超净工作台、低温冰箱、 高压灭菌锅、制冰机、微波炉、恒温培养箱、紫外-可见分光光度计、焦磷酸测序仪等 5.2用具 可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL）、吸头、离心管、研钵、微型磨杆等 5.3试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）所需试剂见附录B，免疫层析试纸条检测所需试剂见 附录C,RT-PCR检测所需试剂见附录D,Real-timeRT-PCR检测所需试剂见附录E，焦磷酸测序法鉴 别株系群所需试剂见附录F。 6样品的抽取及制备 6.1抽样 马铃薯贸易商品或科研用薯材料或国际间种质交流材料等现场抽样按照SN/T2122的规定执行， 田间调查采样按照GB7331的规定执行。 6.2马铃薯组培苗、微型薯、块茎等样品的制备 将马铃薯组培苗、微型薯、块茎播于非土介质或灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长 出3片～4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。表现 坏死环斑等可疑症状的块茎、组培苗、微型薯，可直接用于检测，必要时再进行栽培生长实验 6.3茄科等寄主植物种子样品的制备 将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长出 3片～4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。 7检疫鉴定方法 7.1DAS-ELISA检测 见附录B。如选用合格的试剂盒，按试剂盒说明操作。 7.2 免疫层析试纸条检测 见附录C。如选用不同生产商的合格产品，按其操作说明操作。 7.3 3RT-PCR检测 见附录D。 7.4Real-timeRT-PCR检测 见附录E。 7.5免疫电镜检测 按照SN/T1840的规定执行。 2 GB/T 36816—2018 7.6焦磷酸测序法鉴别株系群 见附录F。如果没有焦磷酸测序设备，亦可采用达到相同效果的其他测序方法，结果判断不受 影响。 7.7鉴别寄主检测 见附录G。 8结果判定 8.1无可疑症状的样品，经PVY特异性的血清学检测（7.1、7.2任选一种）或分子检测（7.3、7.4任选一 种）后，任意一项结果为阴性时，则判定样品不带有PVY；有可疑症状的样品，经PVY特异性的血清学 检测（7.1、7.2任选一种）和分子检测（7.3、7.4任选一种）后，两项结果均为阴性时则判定样品不带 有 PVY。 8.2PVY特异性的血清学检测结果（7.1、7.2任选一种）、分子检测结果（7.3、7.4任选一种）、免疫电镜 检测结果（7.5）中任意两项为阳性时，则判定样品带有PVY。 8.3PVY特异性的血清学检测（7.1、7.2、7.5任选一种）、分子检测（7.3、7.4任选一种）任一结果为阳 性，并经鉴别寄主检测（7.7)在烟草上产生叶脉坏死症状，则判定样品带有PVY并属于N株系群。焦 磷酸测序法（7.6)两个测序引物的测序结果都符合的，则判定样品带有PVY并属于N株系群；只有 个符合的，若经鉴别寄主检测（7.7）在烟草上产生叶脉坏死症状，亦判定样品带有PVY并属于N株 系群。 9样品保存与结果记录 9.1样品保存 样品直接放于一80℃冰箱或冷冻干燥后放于一20℃或一80℃冰箱保存1年，保存的样品要做好 标记和登记工作，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，应经灭活处理。 9.2结果记录 完整的实验记录要包括样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的 应有电泳结果图片，Real-timeRT-PCR检测应有扩增曲线结果图片，免疫电镜检测和焦磷酸测序应有 结果图片。 3 GB/T36816—2018 附录A （资料性附录） 马铃薯Y病毒背景资料 A.1寄主范围 马铃薯Y病毒的自然寄主非常广泛，包括多达9个科的植物，其中涉及重要的作物，如辣椒（Cap sicum spp.）、马铃薯（Solanumtuberosumssp.tuberosum）、烟草（Nicotianaspp.）、番茄（Lycopersicon esculentum），还涉及一些园艺作物（Dahliaspp.和Petuniaspp.）及很多杂草（Datura spp.，Physalis spp.，Solanumdulcamara和S.nigrum）。在新西兰已记录了新的自然侵染寄主：南方山芜要（Cotula australis）和荠菜（Capsellabursa-pastoris)。 已报道的人工接种可侵染的实验寄主包括31个科72个属的495种植物，其中包括茄科（Solanace ae)14个属287种植物（这其中含141种茄属植物和70种烟草属植物）、苋科28种、豆科25种、藜科 20种、菊科11种。 A.2株系 目前大家普遍接受的株系划分方法是根据该病毒在烟草（Nicotianatabacumcvs.WhiteBurley andSamsunNN）、洋酸浆（Physalisfloridana）及不同马铃薯品种上的症状表现，将马铃薯Y病毒划分 为普通株系（PVYO）、烟草脉坏死株系（PVYN）PVYC三个主要株系群，随着研究的深入，有学者依据 该病毒与具有不同基因型背景的马铃薯品种互作的病理效应，并结合在烟草上的症状将PVY分为O、 N、C、Z、E等多个不同株系类群，其中类群N又可分为PVYN、PVYNTN、PVYNWi等多个株系。 A.3地理分布 马铃薯Y病毒在世界马铃薯种植区范围内广泛分布。在马铃薯作物上，PVYO株系世界范围内发 生。PVYN株系已经在南美、欧洲、非洲、亚洲以及新西兰有报道，但在加拿大和美国却是检疫性有害生 物，在那里局部发生。据目前所知PVYC株系在欧洲、北美洲、印度、南非、澳大利亚、新西兰和厄瓜多 尔有发生。PVYNTN株系在世界大多数马铃薯种植区已鉴定，包括美国、日本、秘鲁。PVYN-W株系在 波兰已成为流行株系，并在其他国家已经报道，包括法国、西班牙、德国和俄罗斯。PVYN.0株系在加拿 大和美国有报道。 A.4基因组特征 病毒粒子为弯曲线状，无包膜，长680nm～900nm，直径11nm～13nm。为单分子线形正义ssR NA，长约9.7kb，编码的多聚蛋白切割产生10个蛋白。 A.5寄