ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36832—2018 黑高梁检疫鉴定方法 Detection and identification of Sorghum almum Parodi. 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36832—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准负责起草单位:中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:印丽萍、薛华杰、吴志毅、傅怡宁、张宁。 GB/T368322018 黑高梁检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了黑高梁检疫鉴定的形态学方法和分子筛查方法。 本标准适用于黑高梁的检疫鉴定。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 小穗spikelet 小型的穗状花序或次级穗状花序,由两枚苞片(颖片)包裹的一至多花组成的末级花穗 2.2 小花 floret 由禾本科的花同包被其外的内外荐组成的结构。 2.3 小穗轴 rachilla 每个小穗有一短轴,其上着生1朵至多朵小花。 2.4 片 squama 禾本科小穗上的小花外面的两片苞片。 注:在外一片为外(lemma),包着的内部一片为内(palea)。 2.5 颖片glume 禾本科植物基部的苞片。 注:基部常有一对,生下面或外面的一片称第一颖(firstglume),生上方或里面的一片称第二颖(secondglume)。 3基本信息 3 学名:Sorghum almum Parodi. 英文名:Columbus grass,almum grass,almum sorghum 中文名:黑高粱、杂高粱 分类地位(恩格勒系统):被子植物门Angiospermae,单子叶植物纲Monocotyledoneae,禾本目 Poales,禾本科Poaceae,高梁族Andropogoneae,高梁属SorghumMoench。 分布:阿根廷、美国、智利、新西兰、澳大利亚、南非、加拿大、俄罗斯。 传播途径:黑高梁常以种子(小穗)形式混人粮谷物、羊毛等植物产品中,随货物调运进行传播。 其他信息:高梁属形态学等信息描述参见附录A。 黑高梁是多年生植物,为假高梁与苏丹草LS.sudanense(Piper)Stapf或与野(喀麦隆)高梁 [S.arundinaceum(Desv.)Stapf]的杂交种。黑高梁与同属的假高梁、苏丹草、光高梁、拟高粱等近似 1 GB/T368322018 种难以区别。其小穗(小花、颖果)形态区别见附录B。 4仪器和用具 4.1 仪器设备 体视显微镜(10×~40×)、放大镜、孔筛(孔径5.0m、3.5mm、2.5mm、1.5mm、1.0mm) PCR仪、电子天平(1/10000g)、pH计、冷冻混合研磨仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、解部 镜、涡旋振荡器、冰箱、微波炉。 4.2用具 白瓷盘、载玻片、解剖刀、解剖针、镊子、培养皿、指形管、标本盒、标本瓶、标签、樟脑、干燥剂、可调式 微量移液器(2μL10μL、20uL、100μL、200μL,1000μL)及相应的吸头、微型离心管PCR管、直径 3.0mm的灭菌钢珠等。 4.3主要试剂 植物基因组提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、超纯水、DNAMarker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱 氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、Taq聚合酶、1OXPCR缓冲液。CTAB法提取试剂,见附录C中C.1。 5实验室检测和鉴定 5.1样品检测 5.1.1粮谷类、油籽类 直径大于或等于5.0mm的样品,如大豆、玉米、菜豆等,建议选取孔径为的5.0mm和1.5mm的 圆孔筛,双层筛样;直径在2.5mm~5.0mm的样品,如大麦、小麦、亚麻籽、高梁等,可采用3.5mm和 2.5mm圆孔筛,双层筛样;如直径小于或等于2.5mm的样品,如芝麻,油菜籽等,可采用2.5mm和 1.0mm圆孔筛,双层筛样 分次将样品倒入上层筛中,每次样品量不超过上层筛内高度的1/2。每次筛样,同一方向近同一平 面旋动10次20次。筛样完毕后,将每层筛上物和筛下物分别倒白瓷盘中。 用载玻片仔细拨动上层筛的筛上物,并用镊子将疑似黑高梁的种子(小穗)放入培养血中,待镜检。 在样品倒入白瓷盘、筛样等过程中,发现的疑似黑高梁的植株应挑出,放人白瓷盘中,待镜检 5.1.2原羊毛、落毛 将原羊毛、落毛在白磁盘中展开,仔细检查混入的杂草。 将疑似黑高梁的植株挑出,放白瓷盘中,待镜检。 用镊子将疑似黑高梁的种子挑出,放入培养血中,待镜检。 5.1.3集装箱残留物 将集装箱残留物倒入白瓷盘中,摊平,仔细检查。 将疑似黑高梁的植株挑出,放入白瓷盘中,待镜检。 2 GB/T36832—2018 5.2镜检 在解部镜或放天镜下镜检。进行植株花部特征和小穗内部特征观察时,辅以解部刀、解部针等 工具。 5.3鉴定方法 5.3.1形态学鉴定 5.3.1.1茎 根状茎,短而弯曲。 秆,直立,不分枝或有时自下部节上分枝;高1.8m~2.8m,有时可达4.5m,直径6mm~110mm; 8节~10节;秆节间,实心,长7cm~40cm,光滑,上部无毛;秆节被短柔毛。黑高梁的根状茎形态参见 附录D中图D.1。 SAC 5.3.1.2叶 叶鞘无毛或基部有柔毛;叶舌,长2.5mm~3.5mm,硬膜质,顶端近平截,无毛;叶片表面光滑,无 毛,线形至线状披针形,长25cm~50cm,宽2cm~5cm,中部最宽,向两端渐狭窄,中脉白色,边缘软 骨质,具微细的小锯齿。黑高粱的叶鞘形态参见图D.1。 5.3.1.3花序 圆锥花序长约40cm,分枝较细而斜升,单生或数枚在主轴上轮生或近一侧着生,基部腋间具灰白 色柔毛;每一总状花序具2节~5节,下部裸露部分长1.5cm~4.0cm;总状花序轴与小穗柄不易折断。 黑高梁的花序形态参见图D.1。 5.3.1.4小穗 无柄小穗椭圆形或长椭圆形,长5.5mm~6.5mm,上端具柔毛或近于无毛,宽1.5mm~2.0mm, 成熟后黑色或黄绿色,不脱落或迟缓脱落,基盘钝,具短柔毛;颖坚纸质或薄革质,第一颖具5脉~7脉, 上部明显,除背部的毛较蔬或无毛外,其余部分的毛较多,第二颖上部具脊。无柄小穗内含2小花,第一 小花不育,第一外椭圆形,膜质透明,边缘具纤毛,2脉;无明显内。第二外披针形,顶端钝或微 尖,膜质,具2脉,第二内顶端多少2浅裂;芒细弱,长约10.0mm,自第二外裂缝间伸出;鳞被2枚 宽倒卵形,顶端微凹,无毛;雄蕊3枚;子房椭圆形。有柄小穗雄性,较无柄小穗狭窄,颖的质地较薄。黑 高梁的小穗形态参见图D.2。 5.3.1.5颖果 颖果卵形或椭圆形,栗色至淡黄色。长3.0mm~3.8mm,宽1.8mm~2.0mm,厚约1.1mm。黑 高梁的颖果形态参见图D.3。 5.3.2DNA条形码筛查鉴定方法 5.3.2.1样品的处理 将需要提取DNA的植物材料(种子为2粒~3粒,硅胶干燥的叶片为10mg),放入2mL的微型离 (30 次/s)。 3 GB/T36832—2018 5.3.2.2DNA制备 采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的CTAB法提取植物基因组总DNA。改良的 CTAB法方法见附录C。 5.3.2.3DNA条形码基因片段扩增 利用trnT-trnL的引物进行序列扩增。引物序列见附录E中E.1,反应体系见E.2,反应程序见 E.3。 5.3.2.4PCR产物的检测 取PCR产物10μL,1.5%琼脂糖凝胶电泳,核酸凝胶染料染色,在凝胶成像系统观察、拍照。 trnT-trnL引物可得到800bp左右的扩增片段 5.3.2.5测序 使用商业化的DNA产物纯化试剂盒对剩余的PCR扩增产物进行纯化并测序。测序引物与PCR 扩增引物相同。 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑,对比峰图,判断序列方向,去除测序引物序列 5.3.2.6比对 PCR产物,经处理后得到721bp~722bp大小的片段。引物处理后的片段测序结果进人NCBI。 登录NCBI数据库BLAST鉴定系统(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对获得的序列进行 比对。 5.4结果评定 5.4.1形态学的结果判定 以成熟植株和(或)果实(颖果)形态特征为依据,符合上述5.3.1形态特征描述的,鉴定为黑高梁。 5.4.2DNA条形码筛查鉴定方法的结果判定 基于trnT-trnL序列,若序列相似性为100%,则判定为黑高梁;若序列相似性小于100%,则需结 合形态学进行进一步判定。比对参考序列见E.4。 6样品保存 6.1标本保存 将最终鉴定为检疫性目标物种的植物组织或DNA置于一20℃低温保存,并注明来源,寄主,采集 时间、地点及采集者,保存期为1年,以备复验,如涉及贸易纠纷则保存到纠纷解决完毕。 6.2原始数据保存 样品检测结束后,将原始记录单(应包括DNA序列及测序峰图等内容)和检验报告归档,妥善保 管,以备复验、谈判和仲裁, 4 GB/T 36832—2018 附录A (资料性附录) 高梁属基本生物学信息 高大的一年生或多年生草本;具或不具根状茎。秆多粗壮而直立。叶片宽线形、线形至线状披针 形。圆锥花序直立,稀弯曲,开展或紧缩,由多数含1节~5节的总状花序组成;小穗李生,一无柄,一有 柄,总状花序轴节间与小穗柄线形,其边缘常具纤毛;无柄小穗两性,有柄小穗雄性或中性,无柄小穗之 第一颖革质,背
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