ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36845—2018 柑橘顽固病螺原体检疫鉴定方法 Detection and identification of Spiroplasma citri Saglio et al 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36845—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准负责起草单位:中华人民共和国南海出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检 疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中华人民共和 国湖南出人境检验检疫局。 本标准主要起草人:谈珺、李凯兵、刘海军、张京宣、李金庆、周慧平、刘晓红、李贺。 GB/T368452018 柑橘顽固病螺原体检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进境植物检疫中相橘顽固病螺原体SpiroplasmacitriSaglioetal的检疫鉴定方法 本标准适用于进出境中的葡萄柚、柠檬、橘子、橙和酸性橙等柑橘属植物种果,苗木及昆虫介体等柑 橘顽固病螺原体的检疫鉴定。 2基本信息 2 中文名:柑橘顽固病螺原体 学名:Spiroplasma citri Saglio et al 英文名:Critus stubborn disease,Little leaf disease of citrus,Stubborn disease of citrus 英文缩写:CSD 分类地位:属植物支原体类病原,细菌域(Bacteria),柔壁菌门(Tenericutes),柔膜菌纲(Mollicutes),虫 原体目(Entomoplasmatales),螺原体科(Spiroplasmataceae),螺原体属(Spiroplasma)。 柑橘顽固病螺原体的其他信息参见附录A。 3方法原理 根据柑橘顽固病螺原体的生物学特性、特异性引物PCR扩增及序列测定结果,荧光定量PCR检测 结果确定病原物种类 仪器设备和主要试剂 4 4.1主要仪器设备 普通PCR仪、荧光PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式 小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜 4.2主要试剂和培养基 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、GoTaq DNA聚合酶、引物和探针。 检验中用到的LD8培养基配制方法见附录D。 5检测鉴定方法 5 5.1症状观察 仔细观察柑橘种苗、果实、叶片等,症状描述参见附录A。 1 GB/T368452018 5.2 病原菌的分离培养 柑橘叶条洗净后用75%乙醇表面消毒5min,磨碎后的汁液接种在LD8液体培养基上,30℃培养 12d,显微镜观察病原物收集情况。 5.3 PCR检测 PCR检测时,用从健康的植物组织DNA为阴性对照,用已鉴定的柑橘顽固病螺原体DNA为PCR 扩增的模板做阳性对照,用ddHzO作空白对照 具体操作步骤见附录B。当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作。 5.4序列测定 扩增片段回收后,进行克隆、测序或直接测序,测序可由生物公司完成, 注:序列对比可利用NCBI网站上的BLA.ST软件进行,网址为:http://wwW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。 5.5 实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测应设置对照,用从健康的植物组织DNA为PCR扩增的模板做阴性对照,用已 鉴定的柑橘顽固病螺原体DNA为PCR扩增的模板做阳性对照,用ddHzO作空白对照 具体操作步骤见附录C。当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作。 6结果判定 当产生以下检测结果时,则判定为检出柑橘顽固病螺原体: 一5.5检测结果为阳性,可判定为检出柑橘顽固病螺原体。 7样品保存与复核 7.1样品、菌株保存 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出柑橘顽固病螺原体的样品应保存于4℃冰箱中,以 备复核。从检测样品中分离并鉴定为柑橘顽固病螺原体的菌株,一80℃长期保存。对不需要长期保存 的菌株应及时高压灭菌处理。 7.2条 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和审核人 员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果图片和实时荧光PCR扩增结果图片。 2 GB/T 36845—2018 附录A (资料性附录) 柑桔顽固病螺原体生物学信息 A.1症状特征 该螺原体病害最典型的症状是感病的叶片通常比正常的小,呈丛簇状排列,叶片发生特有的斑驳; 在严重的感染中,有多个芽和过多的节间,以及树的整体发育迟缓,明显矮化;受感染的树木的果实通常 是带有弯曲的柱状的,同一棵树的果实的不规则性,果实比正常小,味道可能是平淡的、酸的或苦的;种 子大部分无繁殖能力,根系较正常小,有的小根呈异常颜色;非季节性开花、不平衡的水果和过早的水果 掉落也是症状之一,早期症状不明显,有时有隐症现象,症状参见图A.1~图A.4。 注:J.M.Bove,INRA(FR)摄 注:J.M.Bove,INRA(FR)摄 图A.1种子发病症状 图A.2果实发病症状 注:J.M.Bove,INRA(FR)摄 注:J.M.Bove,INRA(FR)摄。 图A.3田间植株发病症状 图A.4田间植株发病症状 A.2寄主范围 在自然条件下,只侵染柑橘属(Citrus)。易感病柑橘属的主要经济宿主包括地中海地区的主要商 业物种:葡萄柚(C.parisi)、柠檬(C.limon)、橘子(C.reticulata)、橙(C.sinensis)和酸性橙(C,au rantium),其他寄主是C.grandis,C.limettioides,C.limonia,C.madurensis,C.jambhiri,C.unshiu 和C.paradisixreticulata(Calavan,198o)。柳杉属和种间根茎类杂种(如香茅草)也是侵染对象,在 3 GB/T368452018 A.3分布 美洲:美国、阿根廷、巴西、墨西哥、秘鲁、苏里南、委内瑞拉、 非洲:阿尔及利亚、埃及、利比亚、摩洛哥、索马里、苏丹、突尼斯 亚洲:伊朗、伊拉克、马来西亚、阿曼、巴基斯坦、沙特阿拉伯、叙利亚、也门、阿拉伯联合酋长国。 欧洲:法国、意大利、西班牙、土耳其、塞浦路斯。 大洋洲:新西兰。 A.4形态特征 柑橘顽固病螺原体呈螺旋形,似纺锤型,宽约0.5μm~2um,长约7μm,能动,无细胞壁,由3层单 位膜所包围。分离所得的细胞质膜的微结构和化学成分,与其他类菌原体相似,主要化学成分为:蛋白 质57%、脂质34%、糖类(包括已糖氨)2.2%;相对分子质量为10°的基因组,细胞内含有DNA,RNA、 核糖体颗粒和可溶性蛋白。 A.5发病条件 该病菌生长最适温度为30℃~35℃,生长最适pH值为7.5。病叶磨碎液在固体LD8培养基上培 养12d(32℃),可见产生具特征性的"荷包蛋”状菌落,菌落大小约0.2mm,呈革兰氏阳性。 A.6 传播途径 主要由取食植株韧皮部的介体昆虫传播,如叶蝉(Scaphytopiusnitridus)、甜菜叶蝉(Circulifer tenellus)和Neoaliturushaematoceps等;感病柑橘种苗、接穗等调运可以使柑橘螺原体远距离传播。 柑橘植株之间的嫁接,可以传播柑橘顽固病螺原体,柑橘顽固病螺原体也可通过传播介体侵染其他植 物,如苋科、藜科、十字花科和卷柏属,若将柑橘顽固病螺原体注射于非媒介昆虫体内,只能存活,不具感 染性。 4 GB/T 36845—2018 附录B (规范性附录) PCR凝胶电泳检测 B.1DNA的提取 B.1.1 切下叶片或果实小柱,75%乙醇表面消毒,并用无菌刀片在5mLLD8肉汤培养基中切割,通过 0.45μm过滤器,并在30℃温育。在3d~14d之后,通过用400×至1000×的暗视野显微镜检查 10uL的培养基来检测存在运动的螺旋螺旋体,确认是否存在柑橘顽固病螺原体。 B.1.2取1g待检样品,剪成小段,用液氮研磨成粉末状,移至一灭菌的10mL离心管中,加入10mL 的65℃预热的提取液(100mmol/LTris-HCl,20mmol/LEDTA,50mmol/LNaCl,1.25%SDS 0.1gPVPpH8.0)混匀,65℃水浴20min。 B.1.3 3加人4mL5mol/L的乙酸钾混匀,冰上静置20min。 B.1.44℃,12000g离心10min,取上清液转人一新20mL离心管中;加入1mL5%CTAB,10mL 三氯甲烷剧烈震荡15s,然后在温室下保持2min~15min后,4℃,12000g离心10min。 B.1.5 5将上清液移至一新管,加人0.6倍体积的异丙醇,混匀,12000g离心10min,弃上清液;70%乙 醇洗涤沉淀,室温干燥后,将DNA溶解在100μL灭菌双蒸水中。 其他的DNA提取方法也可以借鉴,也可以选用商业DNA提取试剂盒,提取的DNA在一80℃的 条件下可以冻存1年。 B.2 引物序列 正向引物:5'-GCGGACAAATTAAGTAATAAAAGAGC-3',反向引物:5'-GCACAGCATTTGC- CAACTACA-3°。本方法的引物扩增区域在基因P58上,GenBank序列号DQ344812,扩增长度

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