ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 36861—2018 饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定 分光光度法 Determination of activity of β-mannanase as feed additive- Spectrophotometric method 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36861—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：浙江大学饲料科学研究所、浙江明珠动物保健品有限公司。 本标准主要起草人：邹晓庭、吴琪、周樱、王小骊、祝春雷、刘国花、谢红云、王凤芹、蒋媛婧、方洛云。 GB/T36861—2018 饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定 分光光度法 1范围 本标准规定了测定饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的分光光度方法。 本标准适用于饲料添加剂β-甘露聚糖酶及其复合酶。本方法的定量限为10U/g。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 β-甘露聚糖酶活力单位β-mannanaseactivityunit 在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中释放1umol还原糖所 需要的酶量为一个β-甘露聚糖酶活力单位（U）。 4原理 β-甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴中与DNS试剂发生 显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-甘露 聚糖酶的活力成正比。通过分光光度计比色测定反应液的吸光度，计算出β-甘露聚糖酶的活力。 5试剂或材料 除非另有说明，试剂均为分析纯。 5.1水：符合GB/T6682中二级水的规定。 5.2氢氧化钠溶液（200g/L）：称取20.0g氢氧化钠，加水溶解，定容至100mL。 5.3乙酸溶液（0.1mol/L）：取冰乙酸0.60mL，加水稀释，定容至100mL。 5.4乙酸钠溶液（0.1mol/L）：称取1.36g三水乙酸钠，加水溶解，定容至100mL。 5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L，pH5.5）：称取23.14g三水乙酸钠，加入1.70mL冰乙酸，再加 水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH，如果pH偏离5.5，用乙酸溶液（5.3）或乙酸钠溶液（5.4）调 节至5.5。 5.63,5-二硝基水杨酸（DNS)试剂：称取3，5-二硝基水杨酸（化学纯）3.15g，加水500mL，45℃水浴 中搅拌5s。然后缓慢加入100mL氢氧化钠溶液（5.2），不断搅拌，直到溶液清澈透明（在加入氢氧化钠 过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加人91.00g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚 1 GB/T36861—2018 硫酸钠。继续45℃水浴加热，补加水300mL，不断搅拌，直到完全溶解。冷却至室温后，用水定容至 1000mL。过滤，取滤液，储存在棕色塑料瓶中，避光保存。室温下存放7d后使用，有效期为6个月。 5.7甘露聚糖溶液（6mg/mL）：称取0.600g甘露聚糖（SigmaG0753），精确到0.001g，加入80mL 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5），磁力搅拌，间断性加热，直至甘露聚糖完全溶解，停止加热，继续搅拌 30min，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）定容至100mL。4℃避光保存，有效期为3d，使用前应搅拌 均匀。 5.8D-甘露糖标准贮备溶液：精确称取预先在105℃干燥至恒重的1.000gD-甘露糖，加乙酸-乙酸钠 缓冲溶液（5.5）溶解，定容至100mL，得到10.0mg/mLD-甘露糖标准贮备溶液。 5.9D甘露糖标准系列溶液：吸取D-甘露糖标准贮备溶液（5.8)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、 5.00mL、6.00mL和7.00mL，分别置于100mL容量瓶中，用乙酸-乙酸钠缓冲液（5.5）定容，摇匀，配制 成D甘露糖标准工作溶液，浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL0.40mg/mL、0.50mg/mL、 0.60mg/mL.0.70mg/mL 6仪器设备 6.1 分样筛：孔径为0.25mm。 6.2 分析天平：感量0.1 mg。 6.3pH计：精度为士0.01。 6.4 磁力搅拌器：附加热功能。 6.5 恒温水浴锅：37℃。 6.6秒表：每小时误差不超过5s。 6.7 分光光度计：吸光度540nm。 6.87 离心机：离心力不低于为2000g。 7试验步骤 7.1 标准曲线绘制 吸取缓冲液（5.5）4.0mL，加入DNS试剂（5.6）5.0mL，沸水浴加热5min。用水冷却至室温，用水 定容至25mL，制成试剂空白溶液。 分别吸取D甘露糖标准系列溶液（5.9）各2mL，加人至25mL刻度试管中（每个浓度做2个平 行），再分别加人2mL乙酸-乙酸钠缓冲液（5.5）和5mLDNS试剂（5.6），用手微振，沸水浴加热5min， 取出，迅速用水冷却至室温，再用水定容至25mL。以试剂空白溶液调零，在540nm处测定吸光度（A 值）。以D-甘露糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线，获得线性回归方程。 每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。 7.2试样酶液的制备 7.2.1固态样品 固态试样应粉碎或充分碾碎，过0.25mm孔径筛。称取适量试样两份，精确至0.0001g，分别置于 200mL锥形瓶中，加入100mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）。摇床或磁力搅拌提取30min，上离心机 4000r/min离心5min，取上清液，上清液再用缓冲溶液（5.5）做二次稀释，使稀释后的待测酶液中β-甘 露聚糖酶活力控制在0.04U/mL~0.08U/mL之间。 1》SigmaG0753是商品名，来源于角豆树种子的胚乳（槐豆胶），给出这一信息是为了给本标准的使用者一个相对 标准，如果其他产品能有相同的效果，则可使用等效产品 2 GB/T36861—2018 7.2.2液态样品 移取适量试样，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）进行稀释、定容，稀释后的待测酶液中β-甘露聚糖酶 酸钠溶液（5.4）调整校正至5.5，再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）适当稀释并定容。 7.3测定 7.3.1移取10.0mL待测酶液，置于具塞试管内，37℃士0.2℃水浴10min。 7.3.2称取2g（精确至0.01g)甘露聚糖溶液（5.7)，至25mL刻度试管中，37℃±0.2℃水浴10min， 加入5mLDNS试剂（5.6），振摇3s，加人2mL经过37℃士0.2℃平衡的待测酶液，振摇3s， 37℃士0.2℃保温30min，沸水浴加热5min，取出，迅速用水冷却至室温，加水定容至25mL混匀。以 试剂空白溶液调零，用10mm比色血，在540nm处测定样品空白溶液吸光度（A）。 7.3.3称取2g（精确至0.01g）甘露聚糖溶液（5.7），加人到25mL刻度试管中，37℃土0.2℃平衡 10min，加人2mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃士0.2℃平衡），振摇3s，37℃士0.2℃精确保温 30min，加入5mLDNS试剂（5.6），振荡混匀，沸水浴加热5min，取出，迅速用水冷却至室温，加水定容 至25mL混匀。以试剂空白溶液为空白对照，在波长540nm下，测定样品管中样液的吸光度（A），通 过线性回归方程计算β-甘露聚糖酶的活力。 8试验数据处理 试样稀释液中β-甘露聚糖酶活力以XD表示，单位为酶活力单位每毫升（U/mL），按式（1)计算： (A-A.)×k+b X1 000 30XM 式中： A 样品管的吸光度； A. 样品空白管的吸光度； k 标准曲线的斜率； b 标准曲线的截距； M D-甘露糖的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)（M=180.2g/mol)； 30 酶解反应时间，单位为分（min）； 1000——单位换算系数。 行分析测定 试样β-甘露聚糖酶的活力以X表示，单位为酶活力单位每克（U/g）或者酶活力单位每毫升 (U/mL），按式（2)计算： SAC X=XDXn .(2) 式中： XD——试样稀释液中β-甘露聚糖酶活力，单位为酶活力单位每毫升（U/mL）； 试样的总稀释倍数。 计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下，两次独立测定结果绝对差值不超过其算术平均值的10%。 GB/T36861—2018 7.2.2液态样品 移取适量试样，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）进行稀释、定容，稀释后的待测酶液中β-甘露聚糖酶 酸钠溶液（5.4）调整校正至5.5，再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.5）适当稀释并定容。 7.3测定 7.3.1移取10.0mL待测酶液，置于具塞试管内，37℃士0.2℃水浴10min。 7.3.2称取2g（精确至0.01g)甘露聚糖溶液（5.7)，至25mL刻度试管中，37℃±0.2℃水浴10min， 加入5mLDNS试剂（5.6），振摇3s，加人2mL经过37℃士0.2℃平衡的待测酶液，振摇3s， 37℃士0.2℃保温30min，沸水浴加热5min，取出，迅速用水冷却至室温，加水定容至25mL混匀。以 试剂空白溶液调零