ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36844—2018 十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Pseudomonas syringae pv. maculicola (McCulloch) Young et al. 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36844—2018 前言 本标准按照GB1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准主要起草单位：中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检 疫局 本标准主要起草人：唐连飞、周慧平、莫瑾、易建平、朱金国、黄迎波、谭建锡 GB/T 36844—2018 十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了十字花科细菌性黑斑病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于干学花科蔬菜及其种子等植物材料中细菌性黑斑病菌的检疫鉴定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 十字花科细菌性黑斑病菌基本信息 3 中文名：十字花科细菌性黑斑病菌 学名:Pseudomonas syringae pv. maculicola (McCulloch) Young et al. 英文名：cruciferbacterialblackspot （Pseudomonas），丁香假单胞菌（Pseudomonassyringae），斑点致病变种。 其他信息参见附录A。 4. 方法原理 根据发病特征、病菌生物学和生理生化特性、分子生物学技术以及致病性等进行检疫鉴定。 C 仪器和用具 生物显微镜、恒温培养箱、电子天平（千分之一）、植物恒温光照培养箱、冰箱、离心机、超净工作台、 PCR扩增仪、实时荧光定量PCR仪、可调移液器等。 6 试剂和培养基 6.1试剂 除另有规定外所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.2培养基 见附录 B。 1 GB/T36844—2018 7检疫鉴定方法 7.1 现场检疫 叶片出现近圆形或不规则形病斑，直径1mm～5mm，初期水浸状，后期呈褐色至黑色，边缘较深； 叶脉病变呈褐色水浸状等症状（参见附录A）。 对现场发现上述类似症状的植株进行取样，进行实验室分离鉴定。取样方法见SN/T2122。 蔬菜种子取样进行实验室分离鉴定。取样方法见GB/T3543.2。 7.2病原菌分离 实验室用水满足GB/T6682要求。 选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位，用无菌水冲洗掉泥沙后置75%乙醇中浸泡2min，用 无菌水清洗3次。在灭菌研钵中研碎，加几滴灭菌生理盐水浸泡15min～20min。用接种环蘸取划线 接种于营养琼脂（NA）平板，接种3个以上。 从种子检测样品中随机抽取50g种子灭菌水洗3次后加入灭菌水100mL浸泡0.5h：0.5%次氯 酸钠表面消毒10min，灭菌水洗3次，加人100mL生理盐水，4℃浸泡过夜；4层纱布过滤，滤液 10000r/min离心15min，1mL灭菌水悬浮沉淀；沉淀悬浮液10倍系列稀释，分别取10倍、100倍和 将接种平板置26℃士1℃培养3d～4d，观察在平面上菌落光滑有光泽，白色至灰白色，边缘初圆 形光滑，质地均匀，后具皱褶，紫外线（254nm）照射产生黄绿色荧光。选取产生扩散性荧光的菌落用 NA纯化培养做进一步鉴定 7.3生化鉴定 7.3.1 LOPAT试验 蔗糖形成果聚糖、氧化酶反应、马铃薯软腐试验、精氨酸双水解反应和烟草过敏反应，按附录B 进行。 LOPAT试验结果为：蔗糖形成果聚糖试验（十）、氧化酶反应（一）、马铃薯软腐试验（）、精氨酸双 水解反应（一）、烟草过敏反应（十）。 7.3.2GATTa试验 明胶液化试验、七叶苷水解试验、酪氨酸酶活性试验、利用酒石酸盐试验，按附录B进行。 GATTa的试验结果为：明胶液化试验（一或缓慢）、七叶苷水解试验（十）、酪氨酸酶活性试验（一）、 利用酒石酸盐试验（十）。 7.3.3Biolog微生物鉴定方法 也可采用Biolog生化鉴定方法进行鉴定。 7.4PCR检测 7.4.1常规定性PCR 录C,用十字花科细菌性黑斑病菌标准菌株基因组DNA作为阳性对照，用不含有十字花科细菌性黑斑 病菌的十字花科组织或种子基因组DNA为阴性对照，用双蒸水作空白对照，进行PCR扩增，将扩增产 2 GB/T36844—2018 条带，则判断为阳性，未出现与阳性对照一致的条带则判断为阴性。 7.4.2实时荧光定性PCR 以分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板，进行实时荧光PCR检测。检测步骤和条件见附录 C,用十字花科细菌性黑斑病菌标准菌株基因组DNA作为阳性对照，用不含有十字花科细菌性黑斑病 菌的十字花科组织或种子基因组DNA为阴性对照，用双蒸水作空白对照，进行实时荧光PCR扩增。 在阳性对照、阴性对照和空白对照均成立的情况下，样品出现阳性信号则判断为阳性，未出现阳性信号 则判断为阴性。 7.5致病性检测 必要时，可进行致病性测定。 将纯化的菌株在KB平板培养生长24h～48h后，用无菌牙签挑菌接种于KB液体培养基中 26℃士1℃，220r/min摇菌培养12h~24h，离心收集沉淀，再用无菌水将菌体沉淀配成 1X10?CFU/mL～1X10°CFU/mL的菌悬液，采用针刺接种分离物分别接种油菜、花椰菜和番茄幼苗叶 片，种后放置于28℃光照培养箱中90%的湿度条件下培养7d后观察是否有症状产生。接种油菜后， 油菜叶片初期产生针尖大小斑点，后变为褐色坏死状病斑，病斑周围伴随着大量黄绿色晕圈，后期病斑 融合成不规则的大坏死斑。接种花椰菜叶片7d后，叶片产生针尖大小的黑褐色小斑点，斑点周围伴随 黄绿色晕圈。接种番茄叶片后，7d后观察叶片也产生黑褐色斑点，但斑点直径较大，症状较油菜和花 椰菜明显，斑点周围也伴随黄绿色晕圈（参见附录D）。从接种发病的油菜、花椰菜和番茄幼苗叶片重新 分离病菌，均可得到与接种物同样的分离物。 8结果判定 8.1分离的菌株符合7.2特征，生化特征符合7.3.1和7.3.2或符合7.3.3，且7.5致病性阳性时，判为检 出十学花科细菌性黑斑病菌。否则判定为未检出十学花科细菌性黑斑病菌。 菌。否则判定为未检出十字花科细菌性黑斑病菌。 9样品保存 检出十字花科细菌性黑斑病菌的样品经登记和经手人签字后妥善保存6个月以上。保存期满后应 经高压火菌后方可处理。 10菌种保存 分离并最终鉴定为十字花科细菌性黑斑病菌的菌株转接到NA培养基试管斜面上，登记和经手人 签字后置于4℃冰箱中保存，30d转接一次。也可将菌株冻干保存。 3 GB/T36844—2018 附录A （资料性附录） 十字花科细菌性黑斑病菌相关资料 A.1分布 国外分布于保加利亚、捷克、丹麦、芬兰、德国、意天利、荷兰、挪威、俄罗斯、乌克兰、英国；日本、韩 国、土耳其；阿尔及利亚、毛里求斯、莫桑比克、南非、津巴布韦；阿根廷、巴西；加拿大、古巴、萨尔瓦多、波 多黎各、美国；新西兰、斐济等国；国内主要分布于浙江、湖北、湖南、云南、广东等省。 A.2宿主 自然寄主：白菜（Brassica chinensisLinn.var.oleifera Makino etNemoto）、萝卜（Raphanus sati- us Linn.var.satious）、甘蓝（Brassica oleracea Linnaeus var.capitata Linnaeus）、花椰菜（Brassica oleracea Linnaeus var.botrytis Linnaeus)、芜菁（Brassica napobrassica Mill.)、芥菜Brassica juncea （Linnaeus）CzemajewJ、油菜（BrassicacampestrisL.）等多种十字花科植物。 A.3发病特征 该病菌在种子上或土壤及病残体上越冬，借风雨、灌溉水传播。由气孔或伤口侵。病菌喜高温高 湿条件，发病适温25℃～27℃，发病要求叶片有水滴存在，一般暴雨后极易发病，而且病情重。在田间 有明显的发病中心，在多雨潮湿的环境条件病害能迅速流行，株发病率100%。病斑初起出现在叶片背 面，初生不规则形、水浸状或油浸状绿色至淡褐色小斑点，直径很小，后变为具有光泽的褐色或黑褐色不 规则形或多边形病斑，薄纸状，不突破叶脉；开始时在外叶发生多，后延及内叶，叶片正面初起为与叶背 对应的青色斑块，当坏死斑融合后形成大的不整齐的坏死斑，可达2cm～4cm以上，后变为淡褐，黑褐 色焦枯状；病菌还可危害叶脉，致使叶片生长变缓，叶面皱缩，开始外叶发生多，后波及内叶；发病严重 时，全株叶片表现为白色灼状斑块，后变为淡褐色焦枯状，导致植株枯黄而死亡。茎及花梗上病斑椭圆 形至线形，水渍状，褐色或黑褐色，有光泽，斑点部分凹陷。角果上产生圆形或不规则形黑褐色，偶成条 斑，稍凹陷。根头部初生暗色病斑后变深，渐成黑色，或不规则圆形斑纹。 A.4病菌生物学特性 菌体短杆状或链状，两端圆形，无芽抱，具1根~5根极生鞭毛，大小（0.8um～0.9um）× （1.