ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 20746—2006 牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、喹乙醇 及代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for the determination of the residues of carbadox,olauindox and related metabolites in bovine and porcine liver and muscle tissues- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20746—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、谢丽琪、欧阳姗、蓝芳、林黎、涂小珂。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T20746—2006 牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、喹乙醇 及代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧及其代谢物脱氧卡巴氧、喹嗯琳-2-羧酸和喹乙醇代谢物 3-甲基喹嗯啉-2-羧酸残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧及其代谢物脱氧卡巴氧、喹啉-2-羧酸和喹乙醇代谢物 3-甲基喹嗯啉-2-羧酸残留量的测定。 本标准的方法检出限：卡巴氧、脱氧卡巴氧、喹啉-2-羧酸和3-甲基喹嗯啉-2-羧酸均为0.5μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2一2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 用乙腈十乙酸乙酯（1+1）溶液提取肌肉和肝脏组织中的卡巴氧，提取液经正已烷脱脂后，旋转蒸发 用甲酸溶液消化试样，使组织中天然存在的酶失活，然后加人蛋白酶水解，盐酸酸化，离心过滤后， 过OasisMAX固相萃取柱或相当者净化。先用二氯甲烷洗脱脱氧卡巴氧，再用2%甲酸乙酸乙酯溶液 液供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3甲酸：色谱纯。 4.4正已烷。 4.5乙酸。 4.6 浓盐酸。 4.7乙酸钠。 GB/T20746—2006 4. 8 二甲基甲酰胺。 4.9乙酸乙酯。 4. 10 中性氧化铝：200目～300目。 4. 11 乙腈+乙酸乙酯溶液（1+1）。 4. 12 甲酸乙酸乙酯溶液：2%。向400mL乙酸乙酯中加人10mL甲酸，用乙酸乙酯定容至500mL。 4. 13 甲酸溶液：0.6%。量取6.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L。 4.14 甲酸溶液：0.1%。量取1.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L。 4.15 甲酸+甲醇溶液（19+1）。用190mL甲酸溶液（4.14)与10mL甲醇（4.1)混合。 4.16 盐酸溶液：0.1mol/L。量取8.3mL浓盐酸用水溶解、定容至1L。 4. 17 盐酸溶液：0.3mol/L。量取25mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L。 4.18Protease蛋白酶：SigmaP5147或相当者，一18℃以下保存。 4. 19 蛋白酶水溶液：0.01g/mL。称取1.00gProtease蛋白酶（4.18），用水溶解、定容至100mL，4℃ 保存。 4.20 乙酸溶液：10%。量取100mL甲酸，用水溶解、定容至1L。 4.21 乙酸钠溶液：0.05mol/L，pH=7。称取6.8g乙酸钠用800mL水溶解，再滴加10%乙酸溶液 以调节溶液pH=7,用水定容至1L。 4.222 乙酸钠十甲醇溶液（19十1）。用190mL乙酸钠溶液（4.21)与10mL甲醇（4.1)混合。 4.23 甲醇+水溶液（1十4）。 4.24Tris碱：Sigma T1503或相当者。 4.25Tris溶液：1.0mol/L。称取121gTris碱，用水溶解、定容至1L,4℃保存。 °%66< 4.27标准储备溶液：100mg/L。准确称取适量标准物质，卡巴氧用二甲基甲酰胺溶解定容，其余标准 物质分别用甲醇溶解定容，配成100mg/L的标准储备液，在一18℃保存，可使用1年 4.28基质混合标准工作溶液：根据灵敏度和使用需要，用空白样品提取液配成不同浓度（ug/L）的基 质混合标准工作溶液，在4℃保存，可使用1周。 4.29内标工作溶液：准确称取适量内标标准物质，用甲醇溶解定容，配成100μg/L的标准工作溶液， 在4℃保存，可使用1周。 4.30阴离子交换柱：OasisMAX60mg，3mL，或相当者。用前分别用3mL甲醇和3mL水活化，保 持柱体湿润。 4.31滤膜：0.2μm 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2固相萃取装置。 5.3氮气浓缩仪。 5.4液体混匀器。 5.5分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.6真空泵。 5.7 均质器。 5.8移液器:10μL~100μ和100μL~1000μL。 2 GB/T20746—2006 5.9聚丙烯离心管：50mL，具塞。 5.10pH计：测量精度士0.02pH单位。 5.11低温离心机：可制冷到4℃。 5.12玻璃离心管：15mL。 6试样制备与保存 6.1试样的制备 将牛、猪肝脏和肌肉组织样品充分搅碎，均质，分出0.5kg作为试样，置于清洁样品容器中，密封， 并做上标记 6.2试样的保存 将制备好的试样于一18℃以下保存。 7测定步骤 7.1卡巴氧的前处理步骤 7.1.1称取5g试样，精确至0.01g。置于50mL聚内烯离心管中，加入5g中性氧化铝（4.10）。 7.1.2加人25mL乙睛+乙酸乙酯溶液（4.11），于液体混匀器上充分混合5min，以5000r/min离心 5min，将上清液移取至另一干净的50mL离心管，加人10mL正已烷（4.4）到管内，振荡2min，以 5000r/min离心5min，弃去上层正已烷，将下层清液转移至150mL鸡心瓶中。 7.1.3重复7.1.2步骤一次，合并两次提取液于同一鸡心瓶中，加人一定量的喹啉-2-羧酸-d4标准 溶液（4.29），使其浓度为2.0ng/g，40℃水浴，减压旋转蒸发至干。 7.1.4准确加人1.0mL甲酸十甲醇溶液（4.15）溶解残渣，过0.2um滤膜后，供液相色谱-串联质谱 仪测定。 7.2脱氧卡巴氧、喹噁嘛-2-羧酸、3-甲基喹嘛-2-羧酸的前处理步骤 7.2.1称取5g试样，精确至0.01g。置于50mL聚内烯离心管中，加入10mL0.6%甲酸溶液 （4.13），混匀后，置于（47土3）℃振荡水浴中振摇1h；先加人3mL1.0mol/LTris溶液（4.25）混匀，再 加入0.3mL蛋白酶水溶液（4.19），充分混勾后，置于（47士3）℃振荡水浴中酶解16h~18h。加入 20mL0.3mol/L盐酸溶液（4.17），振荡5min，在10℃以5000r/min离心15min，上清液过滤 7.2.2将滤液（7.2.1)移人OasisMAX固相萃取柱（4.30)中，待样液全部流出后，用30mL乙酸钠十 甲醇溶液（4.22)淋洗固相萃取柱，真空抽干15min。 7.2.3在一支干净的玻璃管内加入一定量的喹琳-2-羧酸-d4标准溶液（4.29），使其浓度为 2.0ng/g，再用4X3mL二氯甲烷将脱氧卡巴氧洗脱至管内，在45℃用氮气浓缩仪吹干。 7.2.4固相萃取柱再用3×3mL甲醇3mL水，3×3mL0.1mol/L盐酸溶液（4.16）和2×3mL甲 出液，最后用3mL甲酸乙酸乙酯溶液（4.12)洗脱喹嗯啉-2-羧酸和3-甲基啉-2-羧酸到7.2.3所用 0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3色谱测定 7.3.1液相色谱条件 a）色谱柱：InertsilODS-3，3μm，100mmX2.1mm（内径)或相当者； b） 流动相：甲醇、乙腈以及0.1%甲酸溶液，梯度洗脱条件见表1； c) 流速：0.2mL/min； 3