ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36779—2018 芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Fusarium oxysporum f. sp. api 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36779—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国烟台出人境 检验检疫局。 本标准主要起草人：张卫东、黄永辉、权永兵、宋凤鸣、迟远丽、徐淼锋、廖力、林伟、李金庆、于金迪。 GB/T36779—2018 芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了芹菜枯萎病菌检疫鉴定的方法。 本标准适用于可能携带芹菜枯萎病菌的种子、种苗、植物残体及土壤中芹菜枯萎病菌的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2589植物病原真菌检测规范 3芹菜枯萎病菌基本信息 中文名：芹菜枯菱病菌 学名:Fusarium orysporum Schlecht.f.sp.apii Snyder et Hansen.1940 异名:Fusarium bulbigenum Cooke et Massee.1887,Fusarium orthoceras Appel et Wollenw.1910. Fusariumangustum Sherb.1915,Fusarium orthoceras var.apii(Nelson et Sherb.)Wollenw et Rein- king.1935,Fusarium apii Nelson et Sherb.1937,Fusarium apii var.pallidum Nelson et Sherb.1937, Fusarium orysporum f.apii(Nelson et Sherb.) Snyder et Hansen.194o,Fusarium bulbigenum var. apii(Nelson &Sherb.)Raillo.1950 目（Tuberculariales）、瘤座孢科（Tuberculariaceae）、镰刀菌属（Fusarium）。 芹菜枯菱病菌的其他信息参见附录A。 4原理 芹菜枯萎病菌的危害症状、菌落的培养性状、寄主范围、分子生物学特性、致病性测定结果等特征是 其鉴定的主要依据。 5仪器设备、用具和主要试剂 5.1仪器 PCR仪、光照培养箱、生物显微镜（100X～1000X）、体视显微镜、组织研磨仪、生物安全柜、高速冷 冻离心机、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、电子天平（感量0.0001g）、pH计、高压灭菌锅 5.2用具 酒精灯、纱布、烧杯、接种针、接种环、培养血皿、锥形瓶、棉花塞、载玻片、盖玻片、铝铂纸、解剖刀、解部 1 GB/T367792018 剪、镊子、记号笔、移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2.5μL）和离心管。 5.3 主要试剂 无水乙醇、氯化钠、饱和酚、氯仿、次氯酸钠（NaCIO）、异丙醇、异戊醇、五氯硝基苯（PCNB）、冰醋 酸、β-巯基乙醇、Tris-盐酸、Na2EDTA、十二烷基硫酸钠（SDS)、十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)、聚乙烯 吡咯烷酮（PVP）、溴化乙锭、DNA分子量标准、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 6现场检疫 取样时应针对性检查，注意检查有无可疑病株，若有可疑病株应将其挑出来，并送实验室进一步检 验鉴定。在以上针对性检查基础上，再按照SN/T2122的规定执行。 7检疫鉴定方法 7.1症状检查 7.1.1种子症状检查 在解剖境下挑选皱缩、干癌、变色、残缺的或有霉变的种子，分成2份，每份种子样品不少于500粒， 其中一份用于PCR初筛，另一份用于病原菌的分离鉴定。 7.1.2植株症状检查 取待检植株，观察植株是否存在生长不良、矮小衰弱、叶柄褪色、叶片变黄等外观变化，纵切叶柄检 查维管束是否变褐褪色（参见附录B），检查植株有无附着土壤。 7.2PCR初筛 7.2.1样品DNA提取 取挑选的种子、植株可疑病变组织或土壤提取DNA（见附录C)。 7.2.2PCR检测 则可报告未检出芹菜枯萎病菌。 7.3病菌分离培养 7.3.1种子 将种子用有效成分为1.25%的次氯酸钠（NaCIO）溶液表面灭菌3min～4min，无菌水洗涤2次，放 25℃光照培养箱里黑暗12h光照12h培养，观察种子上是否出现白色菌丝或霉状物，挑取边缘菌丝移 置PDA培养基平板上纯化。包衣种子可用双蒸水洗去表面的种衣剂。 7.3.2植物组织 取待检样品的组织切成1cm长的小段，冲洗掉表面的泥土杂物后，在75%乙醇中浸泡1min，经无 2 GB/T36779—2018 菌水洗涤后，用灭菌解剖刀横切成长度为2mm～4mm的小方块，放置在垫有3层无菌湿滤纸的培养 Ⅲ中，每血5片～10片，转至25℃光照培养箱里黑暗12h光照12h培养，观察植物残体表面是否出现 白色菌丝或霉状物，挑取边缘菌丝移置PDA培养基平板上纯化。 7.3.3土壤 取2g土壤放人200mL无菌水中，混匀30min，悬浮液稀释10倍，取1mL土壤稀释液涂抹于含 五氯硝基苯（PCNB)的PDA平板上，5个重复，转至25℃光照培养箱里黑暗12h光照12h培养，观察 菌落的产生情况，将可疑菌落转移至PDA培养基平板上纯化。 7.4分离物的纯化 分离物的纯化来用琼胶平板表面单孢子挑取法进行纯化。将分离物上产生的孢子用灭菌水洗下， 稀释到每个培养血中30个左右的抱子，取一定量的抱子悬浮液加到洁净的硬琼胶培养基平板上，25℃ 条件下过夜放置。在生物显微镜下检查，用消毒的解刀或接种针将初萌发单个孢子的小菌块转移到 PDA培养基上。 7.5形态学观察 纯化后的分离物转到PDA上培养，观察记录菌落形态、颜色，大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣 孢子的形态特征；测量菌丝生长速率及分生孢子、厚垣孢子的大小。 7.6病菌分离物的PCR检测 采用CTAB法（见附录C)提取疑似分离物DNA,PCR检测见附录D。 7.7测序 PCR扩增结果为阳性，需将PCR扩增产物进行测序比对，以进一步确证是否为尖孢镰刀菌 7.8致病性试验 将在PDA上培养10d的分离物用100mL无菌水冲洗分生孢子，制成1.0×10个/mL分生孢子 悬浮液，与商业栽培土充分混匀，装人塑料盆中，对照采用清水代替孢子悬浮液接种。将4叶～5叶期 苗龄的健康芹菜苗移植盆中，置于温室（25℃～28℃），每天14h～16h光照，正常淋水管理，接种5周 后检查芹菜植株有无发病，并再次从发病部分离病原菌，观察其形态。 8鉴定特征 8.1培养性状 该病菌在PDA平板上，生长迅速，培养5d后，菌落直径通常4cm~5cm，菌落突起絮状，菌丝由 白色变为淡紫色、淡橙色或米黄色，基物表面淡紫色（参见附录B）。 8.2病原特征 菌丝无色透明，具隔膜，气生菌丝有隔，直径1.5μm～3um。小型分生孢子单胞，无色透明，椭圆形 或卵形，大小4.7um~7.4μm×1.5um~3.7μm；大型分生孢子镰刀形，较稀少，多数为3个隔膜，顶细 胞较尖细，底部具足细胞，大小18.7um～29.6um×3.7μm~4.8um。厚垣孢子间生或顶生，球形，单 个或成对。 3