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ICS 67.050 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21329—2007 动物源性食品中庆大霉素残留量 测定方法 酶联免疫法 Method for the determination of gentamicin residues in animal original foodEnzyme-linked immunosorbent assay 2007-10-31发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21329—2007 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国浙江出入境检验检疫局 本标准主要起草人:施伟良、张晓峰、方莹、谢文、朱振江。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T21329—2007 动物源性食品中庆大霉素残留量 测定方法酶联免疫法 1范围 本标准规定了肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的酶联免疫测定方法 本标准适用于肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的测定 本标准的方法检出下限:肉类和水产品为10.0ug/kg;内脏、牛奶和奶粉中为20.0ug/kg 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件,其随后所 有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研 究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6379(所有部分)测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—1992,neqISO3696:1987) 3原理 微孔板中包被有绵羊抗兔IgG抗体,加人特异性抗体(免抗庆大霉素抗体)、酶标记庆大霉素、庆大 霉素标准品或样品后,特异性抗体与包被的绵羊抗免IgG抗体结合,同时游离庆大霉素和酶标记庆大 霉素竞争性的与特异性抗体结合。通过洗涤除去未结合的庆大霉素和酶标记庆大霉素,然后加人底物 显色,用酶标仪测定吸光度,根据吸光度值得出试样中庆大霉素的含量。 4试剂和材料 除去另外说明外,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 4.1庆大霉素检测试剂盒(组成参见附录A)。 4.2 三氯乙酸。 4.3氯化钠。 4.4氯化钾。 4.5 磷酸二氢钾。 4.6磷酸氢二钠。 4.7 磷酸二氢钠。 4.8 吐温-80。 4.9 3%三氯乙酸:称取3g三氯乙酸(4.2),用水定容至100mL。 4.10 0PBS缓冲液:8.5g氯化钠,1.15g磷酸氢二钠,0.27g磷酸二氢钠,用水定容至1L。 4.11SDB缓冲液:1.15g磷酸氢二钠,0.2g磷酸二氢钾,0.2g氯化钾,30g氯化钠,0.5mL吐 温-80,用水定容至1L。 4.12正已烷。 4.13庆大霉素标准品为USP级。 4.14庆大霉素标准品溶液的配制:用灭菌水作为溶剂配制成50mg/mL的储存液,于一20℃条件 下保存。 1 GB/T21329—2007 5仪器 5.1酶标仪。 5.2八道移液器:50μL~300μL 5.3单道移液器:5μL~50μL,100μL~1000μL和2mL~10mL。 5.4混合振荡器。 5.5离心机。 SAG 5.6 具塞试管:20mL,50mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 对组织样品:从全部样品中取有代表性样品,混匀,用四分法缩分出不小于1000g试样,去除脂 肪、充分绞碎、混均、分装、密封,并加以标识。 对牛奶和奶粉:从原始包装中取有代表性样品,充分混匀,用四分法缩分出不小于500g试样,装入 清洁密闭容器,加封后标明标记。 6.2试样的保存 将样品于-18℃~-20℃条件下保存。 7分析步骤 7.1提取 7.1.1组织 称取2.5g去脂肪均质样品,精确到0.1g,置于50mL具塞试管中,加人5mLPBS缓冲液(4.10 振荡10min,加人10mL的3%三氯乙酸(4.9)涡旋10min,6000r/min离心15min。取3mL上清液 于二干净试管,再加人2mL正已烷(4.12)混合3000r/min离心10min,吸取150μL下层液体加 350μL的SDB(4.11)缓冲液,调节pH至7.5左右。最后稀释倍数为20。 7.1.2牛奶 牛奶样品先离心去脂肪,然后以SDB缓冲液(4.11)直接做10倍稀释;对于奶粉则可以先用与样品 质量相等的水进行稀释溶解,离心去脂,然后再以SDB缓冲液(4.11)做5倍稀释,调节pH至7.5左 右,最后稀释倍数为10。 7.2测定条件 7.2.1酶标仪测定条件 酶标仪测定波长为450nm。 7.2.2洗板条件 7.2.2.1人工洗涤次数5次以上,每次注水量为250μL。 7.2.2.2自动洗板可以预定5次周期。 7.2.3操作条件 所有操作应在室温下(20℃~24℃)进行,庆大霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温 (20℃~24℃)后方可使用。 7.3测定步骤 7.3.1将测定需用的微孔板备齐并插人微孔架上,记录标准品及样品等在微孔架上的位置。 1)给出该信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不 同,需经实验评估后采用。 2 GB/T21329—2007 7.3.2吸取100μL零浓度标准品于孔A1、A2:并吸取50μL零浓度标准品于孔B1、B2;分别吸取 溶液于其余微孔中。 7.3.3分别吸取25μuL庆大霉素酶标记物溶液于除A1、A2外的每一个微孔。 7.3.4分别吸取25uL庆大霉素抗体溶液于除A1、A2外的每一个微孔。 7.3.5用封口膜封孔条,并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀。 7.3.6将酶标板置于4℃避光孵育1h。 7.3.7倒出孔中的液体,将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打,以除去孔中过多的残液,但不能使微孔干 燥。再立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件进行洗板,要注意不能使微孔干燥 7.3.8迅速加人100μL底物溶液于每一个微孔底部,持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后,于 20℃~24℃避光孵育30min 7.3.9迅速加人100μL反应终止液于每一个微孔。持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后,将微 孔架置于酶标仪中,在450nm处测量吸光度(加人反应终正液后应在30min内读取吸光度)。 注:测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。 7.4平行试验 按以上步骤,对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定, 7.5空白试验 除不称取试样外,均按上述步骤进行。 SAC 7.6监控试验 每次测定均应做一个添加庆大霉素标准(4.14)的样品。 8结果计算 从含有标准品和样品的板孔的吸光度(OD)值中,减去空白孔A1、A2的平均OD值。标准品和样 品的OD平均值除以零标准(B1、B2)的平均OD值,再乘以100。零标准为100%(最大吸光度值),其他 OD值为最大吸光度值的百分数 在半对数坐标纸上,以吸光度值为纵坐标(%),庆大霉素标准溶液浓度(ug/L)为横坐标,绘制标准 工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的庆大霉素浓度后,结果按式(1)进行计算: ...(1) mX1000 式中: X一一样品中庆大霉素的残留量,单位为微克每千克(μg/kg); c——从标准工作曲线上得到的样品中庆大霉素浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); V一样品溶液的最终定容体积,单位为毫升(mL); m—样品溶液所代表的最终试样质量,单位为克(g)。 注:所得结果应表示至一位小数。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算, 9确证试验 如被测样品中庆大霉素残留量的值大于限量要求时,应用其他方法进行确证 回收率参见附录B。 3
GB-T 21329-2007 动物源性食品中庆大霉素残留量检验方法 酶联免疫法
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