ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 186522002 致病性嗜水气单胞菌检验方法 Methods for detection of pathogenic aeromonas hydrophila 2002-02-19发布 2002-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 GB/T18652—2002 前言 嗜水气单胞菌在自然界中广泛分布，有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌株可感染鱼类、 两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类等动物，包括鲫、团头鲂、鲢、、鲤、鲮、草鱼、香鱼、狼鲈、虹鳟、尼罗罗非 鱼、斑点叉尾、黄鳝、日本鳗、欧洲鳗、翘嘴、牛蛙、美洲鳄、中华罄、貂、貉、兔、猪、牛等。临床上以急性出 血性败血症为主要特征。慢性感染则主要表现为皮肤溃疡或肠炎。人亦可因致病性嗜水气单胞菌感染 而发生腹泻及食物中毒。 本标准在嗜水气单胞菌的鉴定中，参考了《伯杰氏鉴定细菌学手册》（第九版，1994）中有关嗜水气单 胞菌的内容。 蛋白酶是嗜水气单胞菌重要的毒力决定因子，与该菌的致病性密切相关，凡蛋白酶阳性的嗜水气单胞菌 均具致病性。蛋白酶的检测除采用脱脂奶平板法外，还可采用斑点酶联免疫试验。 本标准可用于嗜水气单胞菌的分离鉴定，而且可区分致病性菌株和非致病性菌株，有助于致病性嗜 水气单胞菌感染的确切诊断。 本标准的附录A、附录B是标准的附录，附录C是提示的附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：南京农业大学动物医学院。 本标准主要起草人：陆承平、陈怀青。 中华人民共和国国家标准 GB/T 18652—2002 致病性嗜水气单胞菌检验方法 Methods for detection of pathogenic aeromonas hydrophila 1范围 本标准规定了致病性嗜水气单胞菌的检验方法 本标准适用于患病鱼类等易感动物及水样中致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定，也可用于送检菌株 的鉴定。 2致病性嗜水气单胞菌检验程序 检验程序的流程示意图见附录C（提示的附录）。 2.1嗜水气单胞菌的分离 2.1.1准备 2.1.1.1各种培养的制备方法见附录A（标准的附录）。 2.1.1.2各种试剂的制备方法见附录B（标准的附录）。 2.1.2待检样本 待检样本可包括病料、水样及送检菌株，病料既可是无菌采取的易感动物的肾、肝、脾等未污染病 料，也可是粪便或病变皮肤等污染病料，如样本为菌株，应先接种于普通肉汤（见附录A中A1），28C培 养24h，再划线接种于普通琼脂平板（见附录A中A2），使之形成单个菌落，以供鉴定用。 2.1.3分离 2.1.3.1未污染病料的分离 2.1.3.1.1接种环（铂金耳）火焰灭菌，冷却。 2.1.3.1.2用接种环蘸取病料。 2.1.3.1.3划线接种于普通琼脂平板。 2.1.3.1.428 C培养24 h。 2.1.3.2污染病料的分离 2.1.3.2.1接种环（铂金耳)火焰灭菌，冷却。 2.1.3.2.2用接种环蘸取病料 2.1.3.2.3接种于RS琼脂平板（见附录A中A3)。 2.1.3.2.428 C培养24 h。 2.1.3.3水样的分离： 2.1.3.3.1用孔径为0.2μm的硝酸纤维素微孔滤膜过滤水样。 2.1.3.3.2取出滤膜，置含有灭菌碱性蛋白陈水（见附录A中A4)的试管中。 2. 1.3. 3. 328 C培养 24 h。 2.1.3.3.4划线接种于普通琼脂平板。 2. 1. 3. 3. 5 528C培养24h。 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准 2002-05-01实施 1 GB/T 18652—2002 2.2嗜水气单胞菌的鉴定 2.2.1菌落形态 嗜水气单胞菌在普通琼脂平板上，28C培养24h后的菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色，有特 殊芳香气味。 2.2.2氧化酶试验 2.2.2.1用铂金耳挑取普通琼脂平板上单个菌落少许。 2.2.2.2涂布于浸有1%盐酸四甲基对苯胺（见附录B中B1)的滤纸片上。 2.2.2.310s内观察细菌涂布处的颜色。 2.2.2.4若细菌涂布处出现红色，判为阳性。 2.2.2.5嗜水气单胞菌应为阳性 2.2.3AHM鉴别培养 2.2.3.2穿刺接种AHM鉴别培养基（见附录A中A5）。 2.2.3. 337C培养 24 h 2.2.3.4嗜水气单胞菌的表现为：顶部仍为紫色，底部为淡黄色；细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力 阳性；部分菌株顶部呈黑色。 2.2.4吲哚试验 2.2.4.1在长有细菌的AHM鉴别培养基顶部，滴加3~4滴Kovacs试剂（见附录B中B1）。 2.2.4.2若沿试管内壁出现红色环者，表明产生吲哚，判为阳性。 2.2.4.3嗜水气单胞菌应为阳性。 2.2.5革兰氏染色 2.2.5.1在一干净载玻片上滴加一滴蒸馏水。 2.2.5.2 用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。 2.2.5.3在载玻片上与蒸馏水混合并均匀涂布。 2.2.5.4 自然干燥，火焰固定。 2.2.5. 5 加草酸铵结晶紫染液（见附录B中B2）染1min～2min。 2.2. 5. 6 流水冲洗。 2.2.5.7 加革兰氏碘液（见附录B中B3）作用1min~2min。 2. 2. 5. 8 流水冲洗。 2. 2. 5. 9 加复红酒精染液（见附录B中B4)染50s~60s。 2. 2. 5. 10 流水冲洗。 2. 2. 5. 11 干燥，镜检。 2. 2. 5. 12 嗜水气单胞菌应为革兰氏阴性短杆菌。 2.2.6糖发酵试验 2.2.6.1用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。 2.2.6.2分别接种葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷及水杨苷等5种糖发酵试验管（见附录B中B5）。 2.2.6.328C培养24h。 2.2.6.4凡试验管颜色从紫色变为黄色，表明细菌可发酵该种糖类，判为阳性。 2.2.6.5嗜水气单胞菌可发酵以上5种糖类。 2.3嗜水气单胞菌致病性鉴定 2.3.1脱脂奶平板试验 2.3.1.1用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。 2.3.1.2接种划线于1%脱脂奶蔗糖胰蛋白陈平板（见附录A中A6）。 2 GB/T 18652—2002 2. 3. 1. 3 328C培养24h。 2.3.1.4若菌落周围出现清晰、透明的溶蛋白圈，判为阳性。 2.3.2斑点酶联免疫试验 2.3.2.1用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。 2.3.2.2接种蔗糖胰蛋白陈肉汤（见附录A中A7)。 2. 3. 2. 32 28C摇床（30r/min)培养48h。 2.3.2.4 10000r/min离心10min，取上清。 2.3.2.5用微量加样器取5μL点样于硝酸纤微素膜光面。 2. 3. 2. 6 37C烘干。 2. 3. 2. 7 置20%脱脂奶中，37℃封闭1h。 2. 3. 2. 8 用含吐温-20的磷酸盐缓冲液（见附录B中B6）洗5次，每次2min 2. 3. 2. 9 置1：50兔抗嗜水气单胞菌蛋白酶抗血清中，37C作用1h。 2. 3. 2. 10 用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗5次，每次2min。 2. 3. 2. 11 置1：10酶标羊抗免抗血清中，37C作用1h， 2. 3. 2. 12 用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗5次，每次2min。 2. 3. 2. 13 加3,3-二氨基联苯胺-过氧化氢（见附录B中B7)中显色。 2. 3. 2. 14 待斑点明显后，用去离子水终止显色。 2. 3. 2. 15 设无菌肉汤作阴性对照。 2. 3. 2. 16 以出现明显棕色斑点者判为阳性。 3试验结果分析判定 符合以下特性者应判为致病性嗜水气单胞菌： a）在普通琼脂平板上，28℃培养24h后的菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色，有特殊芳香 气味； b）在AHM鉴别培养基中，顶部仍为紫色，底部为淡黄色；细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳 性；部分菌株顶部呈黑色； c）氧化酶试验阳性，革兰氏染色为阴性短杆菌； d）吲哚试验阳性，发酵葡萄糖、燕糖、阿拉伯糖、七叶苷及水杨苷等5种糖类； e）脱脂奶平板试验阳性或斑点酶联免疫试验阳性。 3